Co Иммунопреципитация Assay с использованием эндогенного ядерных белков из клетки культивировали в гипоксических условиях

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гипоксии, такие как эндогенные и нативные взаимодействия между факторами транскрипции и их транскрипционными корегуляторами в условиях гипоксии. Основное преимущество этой методики заключается в том, что гипоксические клетки собираются в условиях гипоксии, а ядерные фракции используются для ко-иммунопреципитации. В этом протоколе используются эмбриональные клетки почки 293А человека, выращенные в четырех 10-сантиметровых чашках.

Сейте от трех до пяти раз по 10 до шестой клетки на чашку по 10 миллилитров модифицированной среды Dulbeco с добавлением 10% FBS, L-глутамина, пирувата натрия, пенициллина и стрептомицина. Культивируйте клетки в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Через двадцать четыре часа после посева, когда клетки достигнут конфлюенции от 80 до 90%, поместите две чашки в подкамеру гипоксии в перчаточном ящике инкубатора с 1% кислорода и 5% углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия на четыре часа.

Две другие посуды держите при нормоксии. За день до забора обработанных гипоксией клеток предварительно уравновесьте DPBS до гипоксических условий, поместив в подкамеру гипоксии на 24 часа открытую стеклянную стеклянную бутылку с реагентом объемом 100 миллилитров, наполненную DPBS. Примерно за час до сбора клеток поместите в рабочую камеру перчаточного ящика холодильник со льдом, который был уравновешен до 1% кислорода и 5% углекислого газа.

Перенесите флакон с предварительно уравновешенным гипоксическим DPBS из гипоксической подкамеры в технологическую камеру и поместите ее на лед. Через четыре часа после лечения гипоксии перенесите клетки из подкамеры гипоксии в камеру обработки, которая была предварительно уравновешена до 1% кислорода и 5% углекислого газа. Удалите питательную среду путем аспирации и с помощью пипетки объемом 10 миллилитров промойте клетки 10 миллилитров ледяного предварительно уравновешенного гипоксического DPBS.

С помощью пятимиллилитровой пипетки добавьте 5 миллилитров ледяного предварительно уравновешенного DPBS и вытесните клетки путем соскабливания скребком для клеток. Наклоните планшет для культивирования клеток, соберите отделенные клетки с помощью пипетки объемом 10 миллилитров и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Держите трубку с клетками на льду.

Откройте дверцу между камерой обработки и буферной камерой в перчаточном ящике, обе из которых были предварительно уравновешены до 1% кислорода и 5% углекислого газа. Перенесите 15-миллилитровые конические пробирки на льду, содержащие клетки, обработанные гипоксией, из камеры обработки в буферную камеру. Откройте дверцу буферной камеры и полностью извлеките ячейки из перчаточного ящика.

Гранулируйте как гипоксические, так и нормоксические клетки путем центрифугирования при 1000 умноженных на g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Для этой процедуры будет использоваться набор для извлечения ядерного материала. Начните с осторожного суспендирования каждой клеточной гранулы в 500 микролитрах буфера для лизиса NL, дополненного коктейлем ингибиторов протеазы 1X в 0,1 молярного DTT путем пипетирования вверх и вниз несколько раз.

Добавьте в клеточную суспензию 25 микролитров моющего раствора NP и вортексируйте в течение 10 секунд на максимальной скорости. Центрифугируйте при 1000 умножить на 10 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Сохраните и надосадочную жидкость, и ядерную таблетку.

После сбора и хранения надосадочной жидкости, как описано в текстовом протоколе, ресуспендировать ядра клеток, содержащих гранулы, в 500 мкл лизисного буфера NL, дополненного коктейлем ингибиторов протеазы 1X и 0,1 молярного DTT путем вортексирования в течение пяти секунд на максимальной скорости. Ресуспендируйте ядерную таблетку в 50 микролитрах экстракционного буфера NX1, дополненного коктейлем ингибитора протеазы 1X путем пипетирования гранулы вверх и вниз несколько раз. Выдерживать на льду в течение 30 минут.

Каждые пять минут совершайте вихрь в течение 10 секунд на максимальной скорости. Центрифугируйте при 12 000 x g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и переложите в мини-аппараты для диализа с максимальным объемом 100 микролитров на единицу для обессоления.

Закройте крышками мини-устройства для диализа и поместите их во флотационное устройство. Поместите флотационное устройство в стакан, содержащий 500 миллилитров предварительно охлажденного диализного буфера. Будьте осторожны, избегайте прямого контакта с кожей или вдыхания диализного буфера, потому что он содержит PMSF.

Выдерживать при температуре четыре градуса Цельсия при осторожном помешивании в течение 30 минут. Через 30 минут соберите образцы с угла мини-диализных аппаратов и переложите в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте при 12 тысячах умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Аликвотировать по 25 микролитров каждой надосадочной жидкости в центрифужную пробирку объемом 1,5 микролитра и хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия. Приготовьте гранулы белка AG сефарозы для использования в иммунопрецикации. Пипеткой нанесите 50 микролитров шариков в каждую из четырех микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 миллилитров и добавьте по 500 микролитров буфера DPBS на пробирку.

Гранулируйте шарики методом центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах буфера TBS. Добавьте два микролитра мышиного моноклонального антитела к ARNT или мышиного иммуноглобулина G, который был получен путем восстановления 0,7 мг мышиного IgG в 500 микролитрах буфера TBS.

Отнесите микроцентрифужные пробирки, содержащие шарики, в холодную камеру. Поместите их в вращатель трубок и инкубируйте при 10 оборотах в минуту в течение двух часов. Через два часа гранулируйте шарики центрифугированием и выбросьте надосадочную жидкость.

Разведите 200 мкг приготовленного ранее ядерного белка лизата в 800 мкм буфера для иммунопреципитации. Инкубируйте лизат с шариками, связанными антителами, при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день гранулируйте шарики центрифугированием при 3000 умноженных на g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр ледяного TBS, содержащего 0,2% NP-40, в каждую пробирку и убавьте обороты. Таким образом, трижды промойте бусины ледяным TBS, содержащим 0,2% NP-40.

Варите шарики в 50 микролитрах буфера для образцов Laemmli при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Центрифугируйте бусины при 10 тысячах г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Соберите надосадочную жидкость и выбросьте бусины.

В HEK293A клетках исследовали уровни экспрессии в субклеточной локализации компонентов комплекса HIF-1 после лечения гипоксией. Как и ожидалось, уровни общего HIF-1a повышались под действием гипоксии, в то время как уровни ARNT в общих клеточных лизатах существенно не изменялись. Кроме того, гипоксия индуцировала накопление ядер как HIF-1a, так и ARNT.

Эксперименты по коиммунопреципитации проводились с использованием ядерных экстрактов из HEK293A клеток, подвергшихся воздействию нормоксических или гипоксических условий. Как показано на рисунке, HIF-1a был со-иммунопреципитирован вместе с ARNT из ядерных экстрактов гипоксических HEK293A клеток, что указывает на то, что HIF-1a взаимодействует с ARNT в условиях гипоксии. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области гипоксии к изучению эндогенных ядерных белковых взаимодействий белков и их гипоксических условий.