Определение плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, в том числе разгадать клеточные сигнальные пути. Таким образом, основное преимущество этой методики заключается в том, что она на самом деле не требует каких-либо сложных, микроскопических подходов. Он также очень быстр и поэтому может быть использован для наблюдения за распределением белка в клетках в режиме реального времени.

Оценка и количественная оценка мембранного деления периферически ассоциированного белка затруднена из-за дифракции света, которая вызывает смешивание плазматической мембраны и цитоплазматической флуоресценции под микроскопом. Начните эту процедуру с подготовки биологического материала, как описано в текстовом протоколе. Подготовленный материал окрасить красителем FM 4-64, применяя протокол окрашивания, подходящий для исследуемого материала.

Для клеток табака BY-2 окрашивают 200 микролитров клеточной суспензии 0,2 микролитра 10 миллимолярного раствора FM 4-64 в диметилсульфоксид. Чтобы захватить один экваториальный конфокальный срез на одну клетку, установите последовательное двухканальное сканирование для хромофора, используемого в качестве белковой метки, и для FM 4-64. Также установите более высокое оптическое разрешение.

В качестве примера можно привести объектив с 63-кратным масляным погружением с числовой апертурой 1,3 и размером изображения 1,024 на 1,024 пикселя. Установите Fiji ImageJ Distribution и необходимое периферийное устройство для макросов. На Фиджи выберите плагины, затем макросы, затем установите в главном меню и укажите путь к скачанному файлу с периферийным устройством макроса ImageJ.

Установите программное обеспечение R Project и необходимые пакеты. Запустите графический интерфейс пользователя R, выберите пакеты, затем установите пакеты в главном меню и укажите ближайший репозиторий, а также пакет ggplot2 для установки. Загрузите периферийное устройство R Package.

Установите их, выбрав пакеты, затем установите пакеты из локальных файлов. Обработайте конфокальные изображения цитоплазматического маркера. Для этого импортируйте изображения на Фиджи с помощью плагинов, затем биоформатов, затем импортера биоформатов из меню Фиджи с настройками по умолчанию.

Запустите макрос параметров импорта для настройки анализа. Активируйте макрос, выбрав тот же пункт после нажатия на меню инструмента периферического белка меню. Определите соответствующее значение в поле гауссов радиус размытия в пикселях.

Это влияет на сглаживание изображения и шумоподавление. Низкое значение является достаточным и не приводит к потере информации об изображении. Теперь задайте значение в поле профиль ширина линии в пикселях.

Более толстая линия приводит к более высокому сглаживанию кривых профиля. Рекомендуется использовать значение по умолчанию 10 пикселей. Задайте заголовок изображения, парсинг по определению разделителей образцов и экспортируемых элементов.

Нажмите OK. Проверьте разбор титров в следующем диалоговом окне и нажмите OK или назад для сброса. Затем выполните линейную выборку по всей области плазматической мембраны на обработанных изображениях и измерьте профили флуоресценции. Для этого выберите прямую линию инструмента «Фиджи» на панели инструментов «Фиджи».

Щелкните изображение и перетащите линию через область плазматической мембраны. Линия должна начинаться во внеклеточном пространстве и располагаться перпендикулярно плазматической мембране. Выбирайте участки с более толстым и однородным слоем кортикальной цитоплазмы.

Оптимальная длина линейного отбора составляет от пяти до 10 мкм. Запустите макрос профиля дубля, щелкнув инструмент профиля дубля на панели инструментов Фиджи. Будет выполнено автоматическое измерение профилей флуоресценции в обоих каналах, а данные будут отображены в окне результатов.

В зависимости от индивидуальной изменчивости сигнала возьмите репрезентативные номера профилей для каждой ячейки. Запустите макрос данных профиля графика для графической визуализации измеренных профилей. Установите параметр в диалоговом окне вызываемого макроса.

Оставьте неотмеченным флажок использовать фильтрацию входных данных. Укажите, должен ли график создаваться на основе последних данных в окне результатов из одного файла CSV или из всех файлов CSV в указанном каталоге, нажав соответствующий переключатель. Укажите, какие коэффициенты группировки будут использоваться для построения графика, установив соответствующие флажки.

Выберите коэффициент I, если все профили должны отображаться в виде уникальных графиков. Не устанавливайте флажки, если все данные должны быть отображены на одном графике. Нажмите OK. Укажите путь и имя файла для сохранения результатов или для возможного импорта данных в следующем диалоговом окне.

Подтвердите анализ, нажав OK в диалоговых окнах, показывающих выполненный R-код. Запустите макрос настройки фильтрации профилей, если некоторые построенные профили имеют избыточные сигналы во внеклеточном или внутриклеточном пространстве. Затем установите параметры в диалоговом окне вызываемого макроса.

Для каждого канала установить в файле соответствующий порог интенсивности, удалить измерения с избыточным внеклеточным или внутриклеточным сигналом. Укажите область, в которой будет применяться порог интенсивности, в поле с координатами X ниже или выше и нажмите OK. Запустите макрос данных профиля графика еще раз, установив флажок Использовать фильтрацию для ввода данных. Теперь добавьте данные из ранее сохраненного файла.

Убедитесь, что все аберрантные профили были успешно удалены, в противном случае улучшите параметры фильтрации. Запустите макрос create model для создания модели плазматической мембраны и распределения флуоресценции цитоплазмы на основе данных калибровки. После установки параметров в диалоговом окне вызываемого макроса, как описано в текстовом протоколе, нажмите OK. В следующих диалоговых окнах укажите путь и имя входного файла и подтвердите анализ, нажав кнопку OK в диалоговом окне, в котором отображается выполненный R-код.

Затем обработайте изображения клеток, экспрессирующих интересующий вас белок. Импортируйте изображения и настройте анализ, как и раньше. Сглаживание и ширина линий должны быть идентичными.

Приступайте к измерению профилей. Проверьте точность профилей с помощью графика и при необходимости установите фильтрацию, как описано ранее. Запустите макрос calculate distribution для вычисления разделения белка между плазматической мембраной и в цитоплазме.

Укажите источники входных данных и модели и, в конечном итоге, настройте фильтрацию данных. Оставьте этот флажок активированным для удаления результатов с остаточной вариабельностью, превышающей ту, если требуется фильтрация результатов. Укажите пороговое значение максимально допустимой остаточной изменчивости, которое может быть необъяснимо декомпозицией сигнала при измерении отдельного профиля.

Выберите коэффициенты группировки выборки, которые могут быть использованы для создания ящичковой диаграммы. Нажмите OK, укажите входной или выходной пути и подтвердите анализ, нажав OK в диалоговом окне, отображающем выполненный R-код. Здесь показано изображение окрашенной FM 4-64 клетки, экспрессирующей растительный белок, который связан с плазматической мембраной посредством N-миристоилирования и электростатического взаимодействия с фосфоинозитидами.

Эти взаимодействия были экспериментально нарушены вортманином. Важность N-миристоилирования была проверена путем мутации глицина на второй аминокислотной позиции, которая служит сайтом N-миристоилирования. Эффект удаления обеих связывающих способностей плазматической мембраны был проверен путем усечения N-концевого домена белка.

Полученная ящичковая диаграмма показывает снижение сродства к плазматической мембране после мутации сайта N-миристоилирования и после лечения препаратом. Их взаимный эффект сравним с эффектом удаления N-концевого домена. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как в правильном порядке проводить основные этапы анализа и как задавать их параметры.

После этого анализа может быть применен статистический метод, такой как ANOVA, для статистической оценки полученных данных. Хотя этот метод был разработан для растительных суспензионных клеток, он также может быть применен к другим клеткам или тканям с гладкими и четко различимыми плазматическими мембранами.