Методы для обнаружения новых соединений, модулирует гамма - аминомасляная кислота рецепторов типа синапсах

Общая цель этого видео — проиллюстрировать каскад скрининга, который позволяет открыть новые лиганды рецепторов ГАМК-А. Преимущество использования связывания радиолиганда, электрофизиологической записи в ооцитах xenopus и в срезах мозга грызунов литеративным способом заключается в том, что профиль соединения может быть улучшен. В конечном счете, идентифицированы сильнодействующий подтип, селективные и эффективные соединения.

Эту демонстрацию проведут Кумико Камбара и Дженна Тоньяччини, а также Соня и Даниэль Бертран из HiQScreen и Мари Клэр Пфлимлин из Roche. Введите от 10 до 50 нанолитров раствора, содержащего плазмиду, с помощью стеклянной иглы для микроинъекций с диаметром наконечника до 100 микрометров, установленной на микроманипуляторе, оснащенном системой эжекции давления, или с автоматизированной системой впрыска. Чтобы начать эту процедуру, держите ооциты при температуре 17 градусов Цельсия, чтобы предотвратить экспрессию белков теплового шока.

Храните микропланшет в зоне хранения с термоконтролем. Затем растворяют исследуемые соединения, которые были положительно протестированы в анализе связывания в OR2, в 0,1 и 1000 микромоль для электрофизиологических записей и утилизируют их в 96-луночной полипропиленовой пластине с плоским дном. Чтобы выполнить запись напряжения на двух электродах, поместите пластину с ооцитами в автоматизированную систему.

Запрограммируйте автоматизированную систему регистрации с помощью интерфейса на основе пиктограмм с этой схемой для соответствующего определения соотношения активности концентрации. Для подгонки кривой, используя иллюстрированную кривую активации концентрации, постройте амплитуду тока как функцию логарифма концентрации агониста. Для электрофизиологической регистрации держите мозг в растворе dACSF, пузырчатом с карбогеном, при комнатной температуре.

Затем рассеките левое образование гиппокампа тонким шпателем. В последующем выполняется разрез поперечных горок толщиной 400 мкм от срединной части гиппокампа с помощью тканевого измельчителя. С помощью кисти для рисования перенесите срезы в камеру записи и выдержите их при комнатной температуре в течение 45 минут.

После этого перфузируйте ломтики с помощью rACSF, пузырчатого с карбогеном, при температуре 35 градусов Цельсия и со скоростью 1,5 миллилитра в минуту. Чтобы зафиксировать всплеск одиночной популяции, поместите срез мозга в камеру, установленную на микроскопе. Перфузируйте срез с rACSF со скоростью три миллилитра в минуту.

С помощью съемника пипетки вытяните микропипетку из боросиликатного стекла с сопротивлением около двух мегаом. Заполните микропипетку раствором, содержащим два моляра натрия хлорида, и поместите его в держатель пипетки. Расположите записывающую микропипетку в пирамидальном слое в области CA1 среза гиппокампа с помощью правого микроманипулятора.

После этого поместите изолированный биполярный платиновый иридиевый электрод в держатель на левом микроманипуляторе. Расположите электрод стимуляции в коллатерах Шаффера в области CA1 среза гиппокампа с помощью левого микроманипулятора. С помощью генератора стимулов подавайте импульс тока на электрод стимуляции каждые 30 секунд и постепенно увеличивайте силу стимуляции до тех пор, пока не появится всплеск популяции.

Отрегулируйте силу стимула, чтобы вызвать всплеск населения, соответствующий 45% от максимальной амплитуды, которую можно получить. Чтобы выполнить парное торможение импульсов, подавайте два импульса тока на электрод стимуляции каждые 30 секунд с помощью генератора стимулов. Установите силу стимула так, чтобы она вызвала всплеск популяции, соответствующий 45% от максимальной амплитуды.

Для испытания соединений необходимо проводить разведение испытуемых соединений в ACSF таким образом, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 0,1%. Добавьте ДМСО в контрольный раствор в той же концентрации, что и в растворе соединения. Записывайте одиночный или парный всплеск популяции импульсов, вызванный коллатеральной стимуляцией Шаффера, каждые 30 секунд в течение не менее 30 минут. Форма пика популяции должна быть стабильной в течение этого исходного периода.

Затем готовят стакан с карбогенированным rACSF, содержащим фиксированную концентрацию исследуемого соединения, и перфузируют раствором срез гиппокампа во время регистрации одиночных или парных всплесков популяции пульса. Кроме того, оцените восстановление от сложного эффекта путем перфузии среза карбогенированным rACSF без соединения. Здесь показано схематическое изображение среза гиппокампа крысы, коллатерали Шаффера, происходящие из аксонов пирамидальных клеток CA3, проецируемых на дендритную арборизацию пирамидальных нейронов CA1.

Микропипетки были помещены в пирамидальный слой для регистрации всплесков популяции и в слой радиатума для дендритной регистрации полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов. Электрод для стимуляции был помещен в коллатерали Шаффера. На этом рисунке показаны всплески популяции, вызванные парными стимулами, подаваемыми через один и тот же стимулирующий электрод с интервалом в 20 миллисекунд.

Реакция популяции на второй стимул имеет меньшую амплитуду, чем реакция на первый стимул. Популяционные всплески регистрировались при отсутствии и присутствии бета-КМП, неселективного рецептора ГАМК А NAM. Бета-КМК увеличивала амплитуду второго всплеска популяции за счет частичного блокирования любого габаергического ингибирования с прямой связью.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как фармакокинетика, занятость рецепторов и эффективность in vivo и фармакология безопасности, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как потенциал клинической разработки идентифицированных соединений.