Быстрое на основе образа бактериальных вирулентности Assay, используя амебы

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области бактериального патогенеза, например, когда в бактериальных клетках экспрессируются эффекторы вирулентности, убивающие хозяина, и каковы состояния вирулентности имплантатонных клеток, прикрепленных к поверхности? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она быстрая, количественная и относительно проста в обращении с клетками-хозяевами. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заметили, что имплантатонная субпопуляция Pseudomonas с поверхностным прикреплением имеет различные фенотипы для уничтожения хозяина.

Для начала выращивания штамма E.coli BR в течение ночи, как указано в текстовом протоколе. Затем доведите культуру кишечной палочки до комнатной температуры. С помощью деревянной палочки впитайте амебу в 750 л культуры.

Немедленно добавьте 700 л смеси амебы E.coli в тарелку GIP. Наклоните пластину, чтобы культура равномерно распределилась по поверхности тарелки. Затем поместите тарелку в ящик, в котором поддерживается повышенная влажность.

Инкубируйте тарелку внутри коробки при температуре 22 С в течение четырех-пяти дней. После окончания инкубационного периода с помощью стерильного наконечника пипетки соберите споры амебы с половины пластины. Затем проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать амебу на наконечнике пипетки в 1 мл среды PS.

Переложите инокуляционную смесь в колбу объемом 250 мл с 25 мл среды PS с добавлением антибактериального раствора. Выращивайте амебу при температуре 22 °C во вращающемся вибростенде со скоростью 100 оборотов в минуту. После культивирования Pseudomonas aeruginosa в течение ночи разведите культуру с помощью среды PSB в чашке Петри 6 см.

Затем встряхните культуру на настольном ротаторе, настроенном на 100 об/мин при 37 °C. Сначала разогрейте в микроволновой печи 50 мл 1%-агара в буфере DB в колбе объемом 250 мл. Добавьте 15 л кальция AM к 15 мл расплавленного агара и аккуратно перемешайте. Вылейте расплавленную агаровую смесь в стеклянную тарелку размером 12 на 10 см и дайте агару застыть в течение десяти минут при комнатной температуре.

Затем с помощью металлической линейки и напечатанной сетки разрежьте застывшую агаровую прокладку на более мелкие участки размером 1,5 на 1,5 см. Следите за тем, чтобы гель оставался увлажненным до тех пор, пока он не будет готов к использованию. Далее, чтобы изолировать прикрепленные к поверхности клетки, удалите жидкую среду из чашки Петри.

Затем вымойте посуду с 1 мл проявочного буфера, чтобы удалить планктонные клетки. Для определения вирулентности клеток поверхностно прикрепленных бактерий добавляют 10 л клеток амебы из ранее полученных поверхностно прикрепленных бактериальных клеток. Чтобы выделить планктонные клетки, переложите 10 л культуры в свежую чашку Петри.

Далее проводят анализ вирулентности планктонных клеток путем смешивания 10 л клеток амебы с ранее полученными планктонными бактериями. Немедленно поместите небольшую агаровую подушечку поверх соответствующей смеси бактерий и амебы на поверхности чашки Петри. Затем удалите лишнюю жидкость, аккуратно пипетируя лишнюю жидкость, и дайте блюду высохнуть в течение 20 минут.

Накройте блюдо крышкой и выдержите его при комнатной температуре еще 40 минут. Наконец, используйте флуоресцентный микроскоп для получения изображений не менее 100 клеток амебы. В этом протоколе была проанализирована вирулентность планктонных и поверхностно прикрепленных клеток Pseudomonas aeruginosa.

Поверхностно прикрепленный дикий тип Pseudomonas aeruginosa убивал амебу, на что указывает круглая форма клеток амебы и наличие флуоресценции кальцеина. По сравнению с планктонными клетками, прикрепленный к поверхности дикий тип Pseudomonas aeruginosa имел высокий индекс уничтожения хозяина. Планктонные клетки потреблялись амебой, на что указывает аморфная форма клеток амебы и относительно небольшая флуоресценция кальцеина.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости использовать свежий запас кальцеина AM и клеток амебы, а также внимательно следить за оптической плотностью амебы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как транскрипционное профилирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: Какие гены активируются в планктонной и поверхностно прикрепленной субпопуляции? После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить экспресс-анализ вирулентности на основе изображений.