Объединяя анализ ДНК в добыче сырой вириона с анализом РНК от зараженных листьев, чтобы обнаружить новый вирус геномов

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов экологической вирусологии, таких как появление новых заболеваний. Основным преимуществом этого метода является очистка вариантов вируса от клеточных компонентов и последующее выделение ДНК из этих вариантов для секвенирования. Эта идея возникла у меня, когда мы обнаружили, что растения в наших теплицах заражены одним или несколькими неизвестными Badnaviruses. Специалисты, которые впервые используют этот метод, могут столкнуться с трудностями по трем причинам. Во-первых, гомогенизация является критически важным этапом для обеспечения качественного выхода продукта. Во-вторых, дифференциальное центрифугирование может привести к образованию нескольких осадков, и необходимо знать, как идентифицировать и разделить эти осадки. В-третьих, интерпретация данных биоанализатора также может оказаться сложной задачей.

На всех этапах данной процедуры следует использовать лабораторный халат и перчатки. Начните с нарезки 80–100 граммов листьев больных растений, предварительно замороженных при температуре −20 °C. Затем измельчите листья в блендере Waring, используя 200 миллилитров буфера для гомогенизации и 0,5% сульфита натрия. Перенесите гомогенат в стакан объемом один литр.

Продолжая использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, добавьте 18 граммов мочевины и 25 миллилитров 10% неионогенного детергента в гомогенат и накройте стакан фольгой. Перемешивайте с помощью магнитной мешалки в течение ночи. На следующий день перенесите гомогенат в центрифужные роторные флаконы объемом 250 миллилитров и центрифугируйте в роторе с фиксированным углом при 4000 ×g при четырех градусах Celsius в течение 10 минут. Соберите супернатант и профильтруйте его через четыре слоя марли. Измерьте объем полученного жидкого гомогената, а затем разлейте его по полипропиленовым центрифужным пробиркам объемом 38.5 миллилитров. Центрифугируйте гомогенат при 40,000 ×g при четырех градусах Celsius в течение 2.5 часов. По завершении центрифугирования проверьте наличие зеленого осадка на дне пробирки и белого осадка вдоль стенок пробирки. Слейте супернатант, сохранив оба осадка, и поместите образцы на лед.

Отделение белого осадка от зеленого является одним из самых сложных этапов процедуры. Это требует терпения и навыка.

Работая в вытяжном шкафу, используйте резиновый шпатель («полисмен»), чтобы разделить осадки. Соскребите и перенесите осадки в разные флаконы для ротора. Поместите флаконы с белыми осадками на лед. Добавьте в каждый флакон один миллилитр воды и перемешайте содержимое путем пипетирования. В течение одного-двух часов каждые пять минут пипетируйте смесь для повторного суспендирования осадка. После того как белые осадки будут переведены в суспензию, выдержите их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

На следующий день центрифугируйте суспензию при 6000 ×g при температуре 4 °C в течение 10 минут для удаления оставшегося клеточного дебриса. Перенесите концентрированные суспензии в новые пробирки и центрифугируйте при 136 000 ×g при температуре 4 °C в течение двух часов для осаждения вирионов. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл буфера.

Начните данную процедуру с разрушения вирионов. Добавьте 40 µL раствора протеиназы K с концентрацией 2 µg/µL в суспензии осадка и инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут. Добавьте в каждый образец один объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт и перемешайте вручную в течение 20 секунд.

Центрифугируйте при комнатной температуре при 16, 000 ×g в течение пяти минут. Удалите верхнюю водную фазу и перенесите ее в новую пробирку. Повторите данную экстракцию два или более раз.

Сконцентрируйте ДНК с помощью осаждения этанолом. Используйте 0,3 M ацетат натрия (pH 5,2) и 2,5 объема 95% этанола. Выдержите образцы при температуре -20 °C в течение 30–60 минут. Затем центрифугируйте при 13 000 ×g в течение 10–20 минут для осаждения ДНК.

Работая за лабораторным столом, ресуспендируйте осадок ДНК в 1 мл 0,1 мМ ТЕ-буфера. Профильтруйте суспензию через коммерческую гель-фильтрационную колонку путем центрифугирования. Проанализируйте образцы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием, чтобы проверить чистоту препаратов и оценить качество ДНК, как описано в тексте.

При исследовании методом просвечивающей электронной микроскопии в белом осадке, полученном путем грубого фракционирования инфицированных листьев канны, были обнаружены вирусные частицы. Агарозный гель-электрофорез ДНК, выделенной из зеленого и белого осадков, выявил в белой фракции две полосы ДНК с высокой молекулярной массой, отмеченные красной и желтой точками.

Целостность РНК, выделенной из инфицированных листьев, также была подтверждена с помощью электрофореза в агарозном геле. На этой диаграмме показано обилие и таксономическое распределение контигов, собранных из неочищенного вирусного препарата. А на этой диаграмме представлены пропорции вирусных контигов, относящихся к семейству Caulimoviridae, роду Badnavirus, а также контигов, связанных с тремя близкородственными видами.

На следующих двух диаграммах показано обилие контигов, полученных в результате секвенирования РНК, в зависимости от их таксономического распределения. Диаграмма справа отображает обилие контигов в популяции вирусных контигов, относящихся к семейству Caulimoviridae, роду Badnavirus и трем близкородственным видам. Сравнение контигов длины вирусного генома, полученных путем секвенирования ДНК и РНК в качестве общего каркаса, подтверждает наличие двух полноразмерных вирусных геномов.

Наконец, анализ методом ОТ-ПЦР с использованием РНК, выделенной из инфицированных вирусом листьев, выявил геномы обоих вирусов.

После освоения выполнение этой методики занимает два дня, в то время как начинающему специалисту может потребоваться три дня. При первом выполнении данной процедуры важно вести учет объема гомогената в каждой из супернатантов, чтобы в конце процедуры можно было сравнить конечный выход ДНК с исходным количеством материала.

После своего открытия этот метод открыл исследователям в области вирусологии растений путь к идентификации новых ДНК-вирусов в окружающей среде. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как гомогенизировать растительный материал, концентрировать варианты и получать достаточный выход ДНК, которую можно использовать для секвенирования следующего поколения. Не забывайте, что работа с мочевиной и фенол-хлороформом крайне опасна, поэтому при работе с этими химикатами всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных очков, перчаток, лабораторного халата и маски. Для безопасного ультрацентрифугирования важно правильно сбалансировать пробирки, поэтому их необходимо взвесить и разместить в роторе друг напротив друга; при этом разница в весе между ними не должна превышать 0.01 г.