Инвазивный метод для активации мыши зубчатой извилине, высокой частоты стимуляции

Общая цель этого эксперимента — наблюдать за влиянием высокочастотной стимуляции на активность нейронов в нейрогенезе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в согласованных клеточных и молекулярных механизмах высокочастотной глубокой стимуляции мозга, таких как индукция активности нейронов и нейрогенез в гиппокампе. Преимущество этой методики заключается в том, что она демонстрирует мощное влияние высокочастотного TBS на активность нейронов и нейрогенез в мозге взрослого человека.

Хотя этот метод может дать представление о влиянии высокочастотного TBS на зубчатую извилину мыши, он также может быть применен к другим системам, таким как базальные ганглии и субталамические области для заболеваний головного мозга в клинике. Чтобы начать эту процедуру, поместите мышь под наркозом на стереотаксическую рамку. Совместите ушные повязки с его головой и аккуратно затяните их, чтобы поддержать центрированную голову.

Возьмитесь за кожу спереди от ушей и удалите около одного квадратного сантиметра ее над черепом. Затем удалите мышцы и другие приспособления, лежащие над черепом, с помощью ватной палочки, чтобы обнажить поверхность черепа. Далее нанесите раствор перекиси водорода для сушки черепа, чтобы выявить линии сагиттального и лямбда-шва.

Затем определите брегму и лямбду. Точка брегмы будет использоваться в качестве исходной точки для установки положения ядра. После этого выровняйте череп на горизонтальной плоскости с помощью этих двух точек.

Следите за тем, чтобы высоты этих двух точек были практически одинаковыми в дорсальной вентральной плоскости. Кроме того, следите за тем, чтобы череп был выровнен в медиальной латеральной плоскости. Затем установите самодельный двухканальный электрод из медной микропроволоки во вращающийся держатель электрода на стереотаксической хирургической раме.

Поместите электрод непосредственно над брегмой и установите его в качестве исходного места. Затем осторожно переместите электрод в правильное положение над черепом, не касаясь его. Используйте цифровой дисплей на стереотаксической хирургической раме, чтобы указать переднее заднее, медиальное латеральное и дорсовентральное положение.

Когда будет определено желаемое место для введения электрода, отметьте положение черным маркером. После этого используйте дорсовентральную стереотаксическую регулировку, чтобы поднять держатель электрода. Затем простерилизуйте сверло 70% этанолом.

Используйте ручную дрель с микроманипулятором, сделайте отверстие для заусенцев точно в отмеченном месте. Используйте стерильный ватный тампон, чтобы остановить кровотечение во время операции. Продолжайте сверлить до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не обнажится.

Используйте изогнутую иглу, чтобы удалить любые костные обрывки, которые образуются во время сверления, и сделайте отверстие на твердой мозговой оболочке, не повреждая нижележащую мягкую ткань мозга. Чтобы убедиться, что отверстие для заусенцев сделано правильно в нужном положении, опустите электрод, чтобы убедиться, что он плавно вставляется в отверстие для заусенцев, не касаясь никаких препятствий. Если сопротивление не обнаружено, медленно введите электрод на целевую глубину от поверхности черепа.

Затем нанесите стоматологический цемент с помощью небольшого шпателя, чтобы удерживать электрод на месте. По мере загустения цемента сформируйте его вокруг вставленного электрода и других костных винтов, чтобы получилась красивая гладкая крышка. Далее отсоедините электрод от электрододержателя.

Извлеките мышь из стереотаксической рамки, и верните ее в теплую клетку. Дайте мышке свободно двигаться и дайте ей восстановиться в течение двух дней в клетке. Для стимуляции необходимо подключить имплантированный электрод к программируемому стимулятору с помощью проводов.

Настройте интерфейс программного обеспечения. Затем установите параметры HFS в виде шести последовательностей из шести последовательностей по шесть импульсов с частотой 400 Гц и интенсивностью стимуляции 200 миллиампер. Поставка HFS в течение желаемого периода времени в соответствии с настройками.

В контрольной группе мышам имплантировали электроды без какой-либо стимуляции. Для окрашивания CFAS стимулируйте подопытных мышей два раза в течение одного дня. Для маркировки BrdU применяйте соответствующие стимуляции как в группе острой стимуляции, так и в группе хронической стимуляции.

Во время стимуляции убедитесь, что мышь бодрствует. Не забудьте убедиться, что провода не перекручены. Когда стимуляция будет завершена, осторожно отсоедините штифт электрода от держателя электрода в разъеме регистрирующей системы.

Для CFAS и окрашивания, примерно через три часа после последнего HFDBS, обезболивайте мышей путем введения пентобарбитала для достижения хирургической плоскости анестезии. Для мечения BrdU, примерно через 12 часов после последней стимуляции HFDBS, сделайте шесть инъекций BrdU контрольной группе и стимулированным мышам с интервалом в два часа. Через 36 часов после последней инъекции глубоко обезболить мышей пентобарбиталом и транскардинально накормить его 50 миллилитрами холодного PBS с последующим приемом 50 миллилитров холодного 4%-ного параформальдегида.

Удалите его голову и сделайте надрез на коже, чтобы обнажить навык. С помощью щипцов слегка отколите череп и аккуратно удалите весь мозг. Затем после фиксации мозг содержит 4% параформальдегида еще на два дня, и переведите его в 30% раствор сахарозы при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.

С помощью криостата разрежьте мозг на корональные срезы размером 20 микрон. Перенесите и закрепите секции на предметном стекле с помощью щетки, и храните их при температуре минус 20 градусов по Цельсию. После этого перенесите предметные стекла в нормальный PBS, не содержащий фиксаторов.

Промойте секции PBS три-четыре раза по пять минут каждый, чтобы удалить излишки фиксатора. Для группы, меченной BrdU, инкубируйте срезы в двух молярах HCL в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия и промойте их в буфере из боляров 0,1 °C. Через 10 минут промойте срезы два раза в PBS по пять минут каждый раз.

Впоследствии инкубируйте секции в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре. Затем инкубируйте срезы с поликлональным антителом против CFAS, антителом против notch one или антителом против BrdU в блокирующем растворе при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Были срезы трижды в PBS в течение 10 минут каждый раз, затем инкубировали их с конъюгированным анти-рабидом Alexa Fluor 568, конъюгированным анти-козлятником Alexa Fluor 488 или конъюгированным антикрысиным вторичным антителом Alexa Fluor 488 в течение одного часа при комнатной температуре.

Был раздел три раза в PBS по 10 минут каждый раз. Затем покройте иммуномеченные участки мозга с помощью монтажной среды, препятствующей выцветанию, содержащей DAPI. Дайте секциям высохнуть на воздухе и храните их в защищенном от света месте при температуре четыре градуса Цельсия.

Здесь показана экспериментальная парадигма лечения HFS в генерации меченых BrdU пролиферирующих нейронов в DG. Животные были разделены на острую и хроническую группы для получения различных моделей стимуляции. После этого животным в обеих группах вводили BrdU на шестой день. На восьмой день животные были обезболены и обработаны для подготовки к криостатным секциям.

Вот изображения иммунофлуоресцентного окрашивания BrdU после HFDBS в DG. Количественный анализ продукции нейронов показал, что острая стимуляция в ДГ не может усилить нейрогенез. В то время как хроническая стимуляция в ДГ значительно регулировала нейрогенез. По сравнению с контрольной группой, количество клеток-мечений BrdU значительно увеличилось в хронической группе, как в ипсилатеральном, так и в контралатеральном полушарии.

Это изображения иммунофлуоресцентного окрашивания BrdU после HFDBS в субрегионе PP. Количественный анализ продукции нейронов показал, что ни острая, ни хроническая стимуляция в ПП не могут значительно усилить нейрогенез. Количество меченых клеток BrdU было относительно стабильным с лечением HFS или без него.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о правильном расположении электрода и успешной стимуляции. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области нейробиологии высокочастотной стимуляции, включенных в модели. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как доставлять высокочастотную стимуляцию в глубокие ядра мозга.