Где вы режете вопросы: Рассечение и анализа руководство для пространственной ориентации мыши сетчатки от глазной достопримечательности

Целью данного протокола вскрытия является предоставление стандартизированной методологии для использования анатомических ориентиров глаза, таких как прямые мышцы, сосудистая щель и градиент S-опсина, для топографической ориентации сетчатки мыши. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они обеспечивают надежный способ точной идентификации дорсального, вентрального, носового и височного полюсов изолированной сетчатки мыши. Начните с определения точки на дорсальной роговице рядом с границей склеры роговицы и между носовым и височным кантхами.

Прикоснитесь к роговице нагретой ручкой для прижигания менее чем на секунду, чтобы создать след от ожога для ориентации. Повторите для второго глаза. Наличие дорсального ожога позволяет идентифицировать верхнюю прямую мышцу.

Для энуклеации используйте изогнутые щипцы, чтобы аккуратно вытолкнуть глаз из глазницы и захватить глазный яблоко снизу. Затем медленно поднимите шар из гнезда, одновременно осторожно перемещая его слева направо, пока шарик не освободится от гнезда. Перенесите глобус с прикрепленными прямыми мышцами в чашку Петри, содержащую средство для рассечения.

Если вы работаете с обоими глазами, обязательно следите за тем, какой глаз левый, а какой правый. Под эндоскопом вскрытия визуально локализуйте дорсальный ожог роговицы и определите верхнюю прямую мышцу, с которой он связан. С помощью ножниц для препарирования или иглы 20-го калибра проколите роговицу в месте ожога.

Затем сделайте глубокий разрез в глазном яблоке по направлению к зрительному нерву, чтобы разрезать верхнюю мышцу пополам. Здесь видна изолированная сетчатка с этим разрезом, а здесь показана реконструированная сетчатка с этим разрезом. Используйте два комплекта щипцов, чтобы изолировать сетчатку, осторожно разрывая отверстие, образовавшееся в результате прокола, пока часть сетчатки не обнажится.

Затем отделите сетчатку от склеры до тех пор, пока склера не будет полностью удалена. Удалите радужную оболочку, хрусталик, стекловидное тело и любые оставшиеся структуры до полной изоляции сетчатки. Наличие дорсального ожога позволяет идентифицировать носовую и височную сосудистую трещину.

При работе с правым глазом носовая сосудистая щель расположена справа от ожога, а височная сосудистая щель — слева от ожога. Это обратная сторона работы с левым глазом. Чтобы использовать ориентир сосудистой щели для определения ориентации сетчатки, найдите и определите сосудистую щель на задней части глаза.

Расположите глобус так, чтобы след от ожога на спине находился на верхнем полюсе, как это было бы, если бы глаз все еще находился в мыши. Затем с помощью ножниц для вскрытия или иглы 20-го калибра сделайте один прокол в глазном яблоке, сначала там, где находится спинной ожог. Затем сделайте неглубокий разрез по направлению к зрительному нерву, где расположен ожог тыльной стороны роговицы.

Затем сделайте следующие два глубоких разреза по направлению к зрительному нерву. Во-первых, выровняв лезвия ножниц для вскрытия с линией височной щели хориоидеи на задней части глаза, а во-вторых, выровняв лезвия ножниц для вскрытия с линией щели носовой оболочки глаза на задней части глаза. Эти разрезы показаны здесь на изолированной и реконструированной сетчатке.

После выполнения этих надрезов с помощью двух комплектов щипцов аккуратно оторвите отверстия для проколов, пока не обнажится часть сетчатки. С помощью ножниц для рассечения сделайте четыре разрезов в сетчатке так, чтобы она лежала ровно. Закрепите сетчатку ганглиозной клеткой вверх на нитроцеллюлозную мембрану, аккуратно прижимая каждый уголок сетчатки к мембране с помощью щипцов.

Затем с помощью щипцов погрузите установленную сетчатку в один миллилитр 4% параформальдегида, содержащегося в первой лунке 24-луночного планшета. Поместите 24-луночный планшет на орбитальный шейкер при комнатной температуре и зафиксируйте сетчатку точно на 40 минут. После фиксации переносят сетчатку во вторую лунку пластины, которая заполняется одним миллилитром 0,1 моляра PBS и промывают сетчатку в течение 15 минут при комнатной температуре.

Когда мытье будет завершено, перенесите установленную сетчатку в пятую лунку, содержащую один миллилитр блокирующего раствора, и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день добавьте кроличье первичное антитело против S-опсина в блокирующий раствор в концентрации один к 500 и инкубируйте в течение трех дней при четырех градусах Цельсия. После трехдневной инкубации избыток первичного антитела смойте с сетчатки шесть раз, последовательно поместив его в шесть лунок, заполненных одним миллилитром PBS на 10 минут каждая при комнатной температуре.

Затем поместите отмытую сетчатку в лунку со свежим блокирующим раствором и добавьте вторичное антитело Donkey Anti-rabbit Alexa 594. Инкубируйте сетчатку с вторичным антителом в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации промойте сетчатку в PBS шесть раз, как и раньше.

С помощью щипцов перенесите установленную сетчатку в чашку Петри, содержащую PBS. Освободите сетчатку от нитроцеллюлозной мембраны, аккуратно вставив кончики щипцов между сетчаткой и мембраной до тех пор, пока сетчатка не перестанет прикрепляться. Погрузите предметное стекло микроскопа в PBS и закрепите сетчатку на предметном стекле, поместив ее на предметное стекло и осторожно проталкивая щипцами до тех пор, пока сетчатка не прилипнет к стеклу.

Накройте сетчатку на предметном стекле монтажным средством и установите покровное стекло 1,5. Поместите предметное стекло в лоток для слайдов и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение часа. Через час установите лоток для слайдов при температуре четыре градуса Цельсия.

После того, как предметное стекло будет закрыто в течение 24 часов, используйте лак для ногтей, чтобы запечатать боковые стороны предметного стекла, чтобы предотвратить высыхание. Это пример сетчатки, выделенной из правого глаза, которая была иммуноокрашена для маркировки S-опсином и визуализирована с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Важно отметить, что разрезы в этой сетчатке произвольны, так как топографическая ориентация может быть определена по градиенту S-опсина.

Полученное изображение сетчатки может быть затем реконструировано в цифровом виде с помощью программного обеспечения ReadiStruct. Оригинальные срезы на этом изображении окрашены в псевдокрасный цвет. Обратите внимание, что выходной файл этой программы неправильно выравнивает сетчатку глаза.

После того, как сетчатка была пропущена с помощью пользовательского лабораторного кода коврика, сетчатка поворачивается таким образом, чтобы самая высокая концентрация окрашивания S-опсином располагалась внизу и определялась как вентральная сетчатка. На этом изображении показана сетчатка левого глаза. Височный полюс расположен под углом 90 градусов против часовой стрелки от вентрального полюса, а носовой полюс расположен под углом 90 градусов по часовой стрелке от вентрального полюса.

После освоения эти методы препарирования могут быть выполнены довольно быстро всего за несколько минут при правильном выполнении. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно и надежно ориентировать сетчатку мыши, используя в качестве ориентира верхнюю прямую мышцу, сосудистую щель или градиент S-опсина.