База данных руководствуясь проточной цитометрии для оценки созревания миелоидных клеток костного мозга
November 3rd, 2018
В отсутствие морфологические критерии или не информативный цитогенетика трудно диагноз MDS. MFC могут помочь уточнить процесс диагностики MDS. Чтобы стать полезным для клинической практики, анализ MFC должна основываться на параметры с достаточной специфичность и чувствительность, и данных, должна быть воспроизводимой между различными операторами.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в диагностике заболеваний миелоидных заболеваний, таких как синдромы миелодисплазии или других гематологических заболеваний, которые развиваются с аномалиями созревания в линиях миелоидных клеток. Основным преимуществом этого метода является то, что он снижает субъективность следователя в этом анализе и интерпретации. Этот метод может дать представление о том, какие параметры являются наиболее дискриминационными для миелодисплазии.
Это позволяет количественно определить различия от нормальных популяций миелоидных клеток. Демонстрацией процедуры будет Tiphanie Пико, аспирант из нашей лаборатории. Начните с смешивания 600 микролитров образца первичной клетки с 10 миллилитров стирального буфера в 15 миллилитровой конической трубки для двух центрифуг и 10 миллилитров свежего буфера стирки на стирку.
После второй стирки повторно приостанавливайте гранулы в 400 микролитров свежего стирального буфера и перенесите 350 микролитров клеточной подвески в пятими миллилитровую полипропиленовую трубку FACS, содержащую всю панель основных антител. После тщательного смешивания клеток, пипетки равные объемы раствора клеточного антитела в три новые полипропилевые трубки, и довести окончательный объем в каждой трубке до 200 микролитров со свежим буфером стирки по мере необходимости. Далее добавьте соответствующий объем антител против маркеров поверхности клетки, представляющих интерес, с смешиванием, для 30-минутной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света.
В конце инкубации добавьте два миллилитров лизайного раствора с перемешиванием, для 10-минутной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света. Соберите лизированные клетки путем центрифугации, и отбросить все, кроме последних 50 микролитров супернатанта в каждой трубке, не нарушая гранулы. Повторно приостанавливайте гранулы в оставшемся супернатанте, с нежным смешиванием, и добавляйте два миллилитров свежего буфера для мытья в каждый образец.
После второй стирки, отбросить супернатант, оставив около 50 микролитров остаточного объема в каждой трубке, не нарушая гранулы. Повторно приостановить гранулы в 200 микролитров PBS с смешиванием, для немедленного анализа. Чтобы прочитать образцы на цитометре потока, сначала откройте новый эксперимент в программном обеспечении цитометра потока, и переименовать эксперимент в соответствии с названием, типом образца и датой.
Создайте новый образец для трех трубок и укажите антитела, используемые в каждой трубке в макете эксперимента. Откройте настройки цитометра и выберите настройки приложения, чтобы применить значения, полученные в ежемесячной настройке. Откройте новый глобальный лист и создайте соответствующие точечные участки для вымывания синглетных клеток, а также для гранулоцитов, моноцитов, взрывных и лимфоцитов.
Создайте новый глобальный лист для элементов управления компенсациями. Затем приобрети 500 000 событий из каждой трубки, по средней ставке приобретения, экспортируют данные в качестве файлов fcs 3.0, после их технической проверки. Прежде чем начать новый анализ, загрузите файлы cyt, содержащие нормальные данные костного мозга, для нейтрофила, моноцита и нуклеатных красных линий, а также файлы анализа в формате inp.
Затем сохраните данные на рабочем столе. Для того, чтобы сохранить созревание нейтрофила в базе данных, сначала откройте программное обеспечение Infinicyt, а затем откройте файл cyt, соответствующий данным о созревании нейтрофилов. Нарисуйте путь созревания на графике APS и сохраните путь созревания нейтрофила в базу данных.
Откройте файл fcs для созревания линии нейтрофила, который должен быть проанализирован. Загрузите файл inp созревания нейтрофила из вкладки профилей. Анализ этой линии разделен на три этапа.
Начните с выбора CD34 положительных, нейтрофиловых взрывов. С этой целью используйте пересечение семи ворот, чтобы позволить выбор CD34 положительные, CD117 положительные, HLADR низкий, CD10 отрицательный, CD13 положительные, CD11 b-отрицательные события. Продолжить анализ с выбором CD117 положительные, CD34 отрицательных нейтрофилов предшественников.
Продолжить анализ с выбором более зрелых нейтрофиловых клеток. Далее, показать анализ моноцитных клеток линии. Нарисуйте путь созревания на графике APS.
Убедитесь, что стрелка, указывающая на чувство созревания, ориентирована из незрелых, моноцитных клеток, CD14 отрицательных, IREM2 отрицательных, к зрелым моноцитам, CD14 положительным, IREM2 положительным. Сохраните путь созревания моноцитической линии в базу данных. Откройте файл fcs для созревания моноцитной линии, который должен быть проанализирован.
Загрузите профиль для анализа моноцитатической линии. Для идентификации моноцитных клеток линии используйте пересечение четырех ворот, что позволяет выбор CD64 положительные высокие, CD117 положительные, CD117 отрицательные, HLADR положительные события. Присвоите эти события моноцитической вкладке в дереве иерархии популяций.
Откройте файл NRC cyt, который должен быть сохранен в базе данных NRC. Нарисуйте путь созревания на графике APS и сохраните путь созревания ядер красных клеток в базу данных. Откройте файл fcs, который должен быть проанализирован.
Загрузите из профилей шаблон анализа нуклеированных красных клеток. Анализ этой линии разделен на два этапа. Начиная с выбора CD34 положительный, эритроид совершил взрывы.
Здесь используйте пересечение семи ворот, чтобы позволить выбор CD34 положительные, CD117 положительные, HLADR низкий, CD105 положительный, CD33 отрицательный, CD36 положительные, CD71 положительные события. Присвоить эти события вкладке NRC в иерархии популяций. Удалите CD34 положительный эритроид совершенных взрывов из видимости.
Для выявления более зрелых эритроидных клеток используйте пересечение четырех ворот, которые позволяют дискриминацию CD45 отрицательных и CD45 положительный низкий, боковой рассеяния низким, CD36 положительный высокий, и CD71 положительный максимум. Затем удалите высокую сторону CD36, рассеяв низкие тромбоциты из нуклеированных красных элементов, и присвоьте эту популяцию вкладке NRC. Для оценки созревания миелоидов в отсеке костного мозга откройте файл цит, соответствующий линии интереса от случая, который должен быть оценен.
Держите видимыми только события, назначенные вкладке нейтрофила, в дереве иерархии популяций. Нарисуйте путь созревания на графике APS и загрузите базу данных, соответствующую созреванию нейтрофила в нормальном костном мозге, и сравните данные. Если данные хотя бы частично совместимы, программное обеспечение создаст нормализованную диаграмму различий созревания и диапазон параметров для визуализации различий созревания.
Для сравнения созревания моноцитов в отсеке костного мозга для нового случая с данными из нормального костного мозга, в том числе в базе данных моноцитов, откройте файл цитов, соответствующий линии моноцитных клеток. Держите видимыми только события, назначенные вкладке моноцитов в дереве иерархии популяций, и нарисуйте путь созревания на графике APS. Загрузите базу данных, соответствующую созреванию моноцитов в нормальных костных мозгах, и сравните данные.
Для сравнения созревания нуклеатных красных клеток в отсеке костного мозга, для нового случая, с данными из нормального костного мозга, включенными в базу данных NRC, откройте файл цит, соответствующий линии NRC. Держите видимыми только события, назначенные вкладке NRC, в дереве иерархии популяций. И нарисуйте путь созревания на графике APS.
Загрузите базу данных, соответствующую созреванию NRC, в нормальные костные мозги и сравните данные. Затем, чтобы визуализировать значение различий между новым файлом и данными, включенными в базу данных, нажмите на нормализованные различия созревания и увеличьте масштаб. Помните, что методы, используя алгоритмы иерархической классификации в анализе цитометрических данных потока, весьма субъективны и по своей сути неточны, поскольку они не учитывают перекрытия популяций клеток.
Оценка новых случаев цитопении, подозреваемых в mdS против миелоидных нормальных баз данных созревания, позволяют идентифицировать аномально выраженные антигены созревания нейтрофилов, моноцитов и линий NRC, даже в случаях без цитологических или цитогенных аномалий. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы приобрести поток цитометрических данных, в стандартизированной манере, для выполнения ежемесячной установки настройки цитометра, ежедневные проверки, пипетки строго антитела перед использованием, и уважать время окрашивания. Следуя этой процедуре, можно выработать другие методы, такие как компас, для сравнения различных групп случаев и ответа на дополнительные вопросы, такие как окончательный типичный отпечаток для определенной группы случаев.
После его развития, этот метод проложил путь для исследователей, заинтересованных в изучении миелоидных клеток созревания моделей, в случаях клонального гематопоеза неопределенного потенциала для выявления окончательных типовых изменений, надежно связанных с диспластическим процессом. Обратите внимание, что обновление базы данных с увеличением числа данных от здоровых доноров может повысить надежность анализа.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Эта статья рассматривает использование многопараметрической цитометрии потоков (MFC) для улучшения процесса диагностики миелодиспластических синдромов (MDS). Она подчеркивает важность специфичности и чувствительности в анализе MFC для клинических приложений.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Гематология
- Миелоидные заболевания
- Диагностические методы
Предпосылки
- Диагностика MDS сложна без морфологических критериев.
- Неинформативная цитогенетика усложняет диагностический процесс.
- MFC может потенциально улучшить процесс диагностики MDS.
- Воспроизводимость данных между операторами является важной.
Цель исследования
- Оценить эффективность MFC в диагностике миелоидных заболеваний.
- Определить наиболее различимые параметры для миелодисплазии.
- Снизить субъективность в анализе и интерпретации.
Использованные методы
- Смешивание первичных образцов клеток с буфером для промывания.
- Выполнение центрифугирования для подготовки образцов.
- Количественная оценка различий от нормальных миелоидных популяций клеток.
- Демонстрация процедуры посттокальным сотрудником.
Основные результаты
- MFC обеспечивает представление о различиях в популяциях миелоидных клеток.
- Техника снижает субъективность исследователя.
- Позволяет количественно оценить различительные параметры.
- Подчёркивается воспроизводимость данных для клинической полезности.
Выводы
- MFC может улучшить точность диагностики MDS.
- Специфичность и чувствительность важны для клинического применения.
- Необходима дальнейшая валидация для широкого клинического использования.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
