Долгосрочный в Vivo отслеживания динамики воспалительных клеток внутри куколки дрозофилы

Используя долгосрочный потенциал визуализации этой новой модели куколки вместе с генетической податливостью дрозофилы, этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области заживления ран и врожденного иммунитета. Стадия куколки имеет некоторые явные преимущества для визуализации в реальном времени по сравнению с более традиционными моделями заживления ран дрозофилы. Например, куколки могут визуализироваться в течение гораздо более длительных периодов времени, большая площадь ткани доступна для экспериментальных манипуляций, и на этой стадии присутствует больше гемоцитов.

Кроме того, эффективность инактивации генов, опосредованной РНК-интерференцией, значительно повышается на этих стадиях куколки, что позволяет сбить многие гены в зависимости от ткани или времени. Чтобы собрать коллекцию куколок, установили флаконы с 20 девственными самками и 20 самцами. Затем за 18 часов до сеанса визуализации соберите не менее 10 вновь сформированных белых предкуколок из флаконов.

Чтобы собрать куколку, используйте щипцы или тонкую кисть, чтобы выбить ее с внутренней поверхности флакона и осторожно перенести на сторону нового флакона от мухи. После того как куколки разовьются к нужному временному моменту, переложите их на кусок двустороннего липкого скотча, закрепленный на предметном стекле. Теперь под микроскопом для диссекции светлого поля аккуратно извлекаем куколки из их оболочек.

Расположите куколок так, чтобы их брюшные стороны были прочно приклеены к ленте. Сделайте первый разрез в самой передней области пупария с помощью щипцов. Убедитесь, что куколка в этой области полая и лишена ткани куколки, потому что куколки будут уменьшаться внутри корпуса во время раннего развития куколки.

Затем осторожно разорвите или разрежьте куколку в переднем и заднем направлениях с помощью щипцов или микроножниц до тех пор, пока куколка полностью не освободится от коричневой непрозрачной ломкой оболочки. Будьте осторожны, эти куколки очень хрупкие. Теперь очень важно, чтобы щипцы и микроножницы не прокалывали поверхность куколки во время этого этапа.

Старайтесь не прикасаться к самой куколке, когда снимаете окружающий корпус. Теперь смонтируйте неповрежденные куколки в чашку со стеклянным дном с помощью гептанового клея. Сначала нанесите на линию приготовленный гептановый клей из 10 микролитров аликвоты.

Затем после пяти секунд сушки с помощью щипцов аккуратно перенесите рассеченные куколки на клей. При обучении выстраивайте в линию до пяти куколок. С накопленным опытом можно подготовить больше.

Скатайте куколки с помощью щипцов для крепления куколок так, чтобы крыло было ровно на покровном стекле, а большая часть поверхности крыла находилась в прямом контакте с покровным стеклом. Наконец, чтобы предотвратить обезвоживание, добавьте кусок абсорбирующей фильтровальной бумаги, смоченный в дистиллированной воде, сбоку от стеклянного дна тарелки. Затем накройте чашку крышкой и приступайте к процедуре лазерного ранения.

Перенесите установленных куколок в широкопольный микроскоп, оснащенный перестраиваемой системой лазерной абляции. Настройте импульсный УФ-лазер для абляции с воздушным охлаждением и азотной накачкой на нужную длину волны с помощью соответствующей ячейки для красителя. Для оптимального ранения установите частоту повторения импульсов на 40 Гц.

Теперь, используя объективы в 40 или 63 раза и светлое поле, отрегулируйте столик микроскопа, чтобы определить местоположение крыла куколки первой куколки, которая должна быть ранена. Сосредоточьтесь на плоскости эпителия крыла куколки, ближайшей к стеклоогибателю. Совместите область, которую нужно ранить, с известной целевой областью абляционного лазера.

Для этого воспользуйтесь маркером перекрестия в окуляре микроскопа. Далее отрегулируйте мощность лазера, отрегулировав предметное стекло аттенюатора плотности энергии в микроскопе. Воспользуйтесь щелчками, чтобы сделать настройку воспроизводимой.

Теперь для изготовления раны активируйте абляционный лазер с помощью быстрого щелчка ручного управления. Затем проверьте наличие переходного пузырька воздуха в месте абляции, что нормально при ранении. Если ранение не увенчалось успехом, попробуйте изменить фокальную плоскость.

В качестве альтернативы постепенно увеличивайте мощность лазера с помощью ползуна аттенюатора до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые размеры раны. После ранения краев крыла куколки быстро перенесите чашку со стеклянным дном в соответствующий микроскоп для покадровой визуализации. Затем откройте соответствующее программное обеспечение для захвата изображений.

В программном обеспечении включите соответствующие лазеры и отрегулируйте их мощность и усиление/смещение, чтобы получить достаточное количество флуоресцентного сигнала без насыщения пикселей. Как правило, минимально возможная мощность лазера в диапазоне от пяти до 20% лучше всего подходит для минимизации фотообесцвечивания. Сосредоточьтесь на всем крыле куколки при малом увеличении или сосредоточьтесь на ране при большом увеличении, чтобы исследовать заживление раны.

Чтобы зафиксировать как восстанавливающийся эпителий, так и набор воспалительных клеток, сначала настройте микроскоп на запись z-стека с помощью точной регулировки фокуса на панели управления. Просканируйте от поврежденного эпителия до внеклеточного пространства под ним, содержащего мигрирующие гемоциты. Затем настройте программное обеспечение на запись z-срезов через крыло куколки каждые три микрона или с еще более узкими интервалами.

Для покадровой съемки записывайте z-стеки не реже одного раза в 30 секунд в течение как минимум одного часа. При использовании фототрансформируемых зондов для выборочного фотопреобразования и маркировки подмножества клеток во время визуализации откройте соответствующие модули в программном обеспечении для обработки изображений для выполнения фотопреобразования и активируйте лазер с яркостью 405 нанометров. Затем выберите ячейки для фотопреобразования в программном обеспечении FRAP с помощью инструмента выделения.

Затем установите временной ход для преобразования фотографий в кадр одной итерации и установите мощность лазера 405 нанометров на 20%. Затем нажмите «Начать эксперимент», чтобы выполнить преобразование фотографий. После завершения выйдите из модуля FRAP и вернитесь к исходному экрану изображения.

Там лазеры настраиваются на используемые флуорофоры и визуализируют фотопреобразованные и нефотопреобразованные клетки с помощью покадровой записи. Поврежденные крылья куколок дрозофилы через 18 часов после образования пупария были визуализированы с помощью конфокальной покадровой микроскопии. Индуцированное лазером повреждение эпителия крыла куколки стимулировало быструю миграцию клеток врожденного иммунитета дрозофилы, называемых гемоцитами, к месту раны.

Гемоциты были помечены как ядерным маркером, так и цитоплазматическим или цитоскелетным маркером, чтобы обеспечить отслеживание и просмотр их морфологии соответственно. Отслеживание ядерных траекторий гемоцитов демонстрирует сложную пространственно-временную динамику воспалительной реакции. В течение 30 минут после ранения гемоциты, расположенные ближе всего к месту повреждения, начинают направленную миграцию к ране.

В конце концов, гемоциты, расположенные все дальше от травмы, начинают мигрировать к ране. С помощью фотоконвертируемого флуорофора Kaede субпопуляции этих гемоцитов мигрирующих крыльев были селективно помечены. Этот метод был использован для того, чтобы показать, что гемоциты, рекрутированные в первоначальную рану, временно десенсибилизируются ко второй ране, образующейся через 90 минут.

Маркируя Е-кадгерин в клеточных адгезивных соединениях с GFP, край раны легко идентифицируется, что позволяет анализировать динамику заживления ран. Большинство ран начинают реэпителизироваться в течение часа после травмы. Край раны продвигается внутрь, и раны в конечном итоге заживают в течение трех часов.

После того, как эта техника будет освоена, несколько куколок могут быть подготовлены к визуализации в реальном времени всего за 10 минут, но при попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что после вскрытия из куколки куколки дрозофилы чрезвычайно уязвимы к повреждениям и обезвоживанию. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области врожденного иммунитета к сотрудничеству с вычислительными биологами и применению более сложного математического моделирования для изучения поведения сигналов раневого аттрактанта, которые отвечают за набор воспалительных клеток. И даже в последнее время альтернативные типы клеток также были помечены, чтобы следовать их реакции на лазерное повреждение, и это показало, что клетки адипоцитов, клетки жирового тела дрозофилы, также реагируют на раны в этой системе.