Администрации экзогенных микросом связанные альфа synuclein агрегатов для первичной нейроны как мощный ячеечная модель формирования фибрилл

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области альфа-синуклеина, такие как выяснение механизма распространения агрегации и токсичности альфа-синуклеина in vivo. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она не требует трудоемкой очистки фреформированных фибрилл альфа-синуклеина. Демонстрировать процедуру будет Люсия Рота, аспирантка из лаборатории COLA.

Чтобы начать процедуру, подготовьте гомогенизационный буфер и держите его на льду. Затем гомогенизируйте свежую или замороженную ткань в объеме от одного до 10 объема ледяного гомогенизатора с помощью тефлонового пестика-гомогенизатора за 10-15 ударов. После этого переложите весь исходный гомогенат в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при температуре 1000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить ядра и неповрежденные клетки в полученной грануле.

Впоследствии отбраковывайте получившуюся дробину. Затем переложите надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную трубку и центрифугируйте ее при температуре 10 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия с использованием охлаждаемой центрифуги для получения второго надосадочной жидкости и гранулы. Затем переложите эту надосадочную жидкость в поликарбонатный флакон и центрифугируйте его при 100 000 перегрузках в течение одного часа при четырех градусах Цельсия с помощью ультрацентрифуги и ротора с фиксированным углом

Суспендируйте сырую таблетку P100 с 500 микролитрами гомогенизационного буфера. Переложите сырую таблетку P100 в чистую микроцентрифужную трубку и центрифугируйте при температуре 10 000 раз больше G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия в охлаждаемой центрифуге. Через 20 минут выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте P100 со 100 микролитрами гомогенизационного буфера.

Затем произведите ультразвуковую обработку образца в течение двух секунд на льду и храните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы выполнить вестерн-блоттинг, нанесите градиент от четырех до 20% трис-глицина полиакриламидного геля на аппарат для вертикального электрофореза. Растворите один микрограмм альфа-синуклеиновых фракций, ассоциированных с микросомами, в буфере для денатурирующего образца и загрузите его в гель.

В другую лунку загрузите пять микролитров белка-стандартного маркера. Запустите гель при напряжении 100 вольт в проточном буфере с трисглицином SDS, пока белковый маркер не достигнет конца геля. Затем перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану с помощью основного карбонатного буфера.

Оставьте образец на ночь в холодильной камере с постоянной мощностью, установленной на 200 миллиампер. На следующий день закройте мембрану PBS-T 5% обезжиренным сухим молоком на орбитальном шейкере на 30 минут при комнатной температуре. После этого кратко промойте мембрану с помощью PBS-T.

Инкубируйте мембрану с антителом SIN-1 в дозе от 1 до 5 000 или антителом к альфа-синуклеину P-Ser129 в дозе от 1 до 5 000 в 2,5% обезжиренном сухом молоке в PBS-T в течение ночи в холодной комнате или холодильнике при температуре 4 градуса Цельсия на орбитальном шейкере. На следующий день промойте мембрану в течение 10 минут при комнатной температуре PBS-T на орбитальном шейкере. Инкубируйте мембрану с HRP-конъюгированными вторичными антителами против мышей или кроликов в концентрации от одного до 3 000 в 2,5%-ном обезжиренном сухом молоке в PBS-T в течение одного часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере.

Затем промойте мембрану в течение 10 минут при комнатной температуре PBS-T на орбитальном шейкере в течение трех раз. Получите сигнал с помощью штатного набора для хемилюминесценции. Для лечения нейронов необходимо извлечь связанные с микросомами агрегаты альфа-синуклеина, полученные из спинного мозга трех различных больных трансгенных мышей, чтобы получить раствор размером один микрограмм на микролитр, разбавленный исходным гомогенизационным буфером.

Затем удалите одну треть среды, и аккуратно замените ее свежей средой нейронов. Добавьте в клеточную среду один микрограмм объединенных альфа-s агрегатов, ассоциированных с микросомами. Верните нейроны в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия.

Добавляйте в пробу одну треть свежей среды без замены один раз в три дня в течение одной недели. После одной недели лечения удалите одну треть среды и аккуратно замените ее свежей средой, содержащей 2% B27, 10 микрограммов на миллилитр гентамицина и два миллимоля глутамина. Повторяйте каждые три дня в течение одной недели перед фиксацией клеток.

Для проведения иммунофлюоресценции в химическом вытяжном шкафу зафиксировать нейроны с 2%-ным параформальдегидом и ПБС в 5%-ном растворе сахарозы на 15 минут при комнатной температуре без встряхивания. Через 15 минут удалите фиксирующий раствор, и кратко промойте нейроны PBS три раза. Затем проникните в нейроны 0,3% неионогенного сурфактина в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем коротко промойте нейроны PBS три раза. Инкубируйте нейроны с 3% FBS и PBS в течение 30 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере, чтобы блокировать неспецифические участки связывания. После этого инкубируйте нейроны с соответствующими первичными антителами, растворенными в 3% FBS и PBS, в течение ночи в холодной комнате или холодильнике на ночь при температуре 4 градуса Цельсия на орбитальном шейкере.

На следующий день удалите раствор антитела, и кратковременно промойте клетки PBS в течение трех раз. Затем инкубируйте нейроны с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами, растворенными в 3% FBS и PBS, в течение одного часа при комнатной температуре в темноте на орбитальном шейкере. Удалите раствор антител и кратко смойте PBS в течение трех раз.

Далее окрашиваем нейроны раствором DAPI в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте на орбитальном шейкере. Через 15 минут удалите раствор антител и кратко промойте PBS в течение трех раз. Закрепите покровные стекла на затворе с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание.

В этом исследовании введение одного микрограмма объединенных агрегатов альфа-синуклеина, ассоциированных с микросомами, от больных трансгенных мышей A53T в культуральную среду нейронов коры головного мозга или гиппокампа индуцирует зависящее от времени образование включений альфа-синуклеина, положительных на агрегат-специфичные антитела к альфа-синуклеину. После двух дней лечения эти агрегаты проявляются в виде небольших разрозненных точек, которые становятся более обильными в последующие моменты времени. Через две недели включения альфа-синуклеина напоминают длинные и зрелые бусинообразные структуры, сильно распределенные по культурам нейронов, следуя нейритному рисунку и частично колокализуясь с пресинаптическими и нейритными маркерами.

При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости корректировки соотношения микрограммов ассоциированных с микросомами агрегатов альфа-синуклеина к плотности покрытых нейронов и выделения ассоциированных с микросомами агрегатов альфа-синуклеина из ткани, богатой включениями альфа-синуклеина. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очищать микросом-ассоциированные агрегаты альфа-синуклеина у больных трансгенных мышей, которые будут использоваться в качестве лечения первичных нейронов, чтобы индуцировать образование включений альфа-синуклеина.