Контраст соответствия моющего средства в малых угол нейтронного рассеяния экспериментов мембраной протеина структурного анализа и моделирования Ab Initio
21 октября 2018 г.
Этот протокол демонстрирует как получить модель с низким разрешением ab initio и структурные детали моющих средств солюбилизирован мембранный белок в растворе с использованием малых угол нейтронного рассеяния с контраст подбор моющего средства.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о интегральных мембранных белках, таких как олигомерное состояние, их размер, общая форма и структура низкого разрешения в растворе. Решение исследований мембранных белков требует стабилизации молекул, таких как моющие средства. Этот метод имеет то преимущество, что он делает моющие средства невидимыми и подчеркивает сигнал от мембранного белка.
Последствия этого метода распространяются на многие биологические и медицинские исследования вопросы, потому что более 1 / 3 белков находятся в мембранах, где они выполняют многие жизненно важные клеточные функции. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку дейтерия маркировки и нейтронного рассеяния шаги трудно узнать, потому что очень немногие учреждения предлагают обучение в этих методах. Для начала определите плотность длины рассеяния нейтронов или SLD с помощью веб-приложения MULCh, модулей для анализа данных контрастных вариаций.
Откройте контрастный модуль, нажав контраст, расположенный в левом навигационном стекле. Предоставьте текст для названия проекта и введите подробную информацию ниже для двух компонентов в качестве подразделения один и подразделение два. Введите молекулярную формулу для каждого компонента в текстовом поле формулы.
Затем введите объем в кубических ангстремах для каждого компонента в коробке ниже объема. Наконец, введите сведения о компонентах буфера. Нажмите представить для выполнения нейтронных контрастных расчетов.
Создается страница результатов, которая обеспечивает таблицу плотности длины рассеяния и точек контрастного матча, а также формулы для определения этих параметров в любом данном проценте D2O в буфере. Просмотрите параметры рассеяния с особым вниманием к точкам контрастности компонентов. Выращивай клетки E.coli, укрывая неизгладимый вектор экспрессии для последовательности целевого белка в среде LB до оптической плотности в 600 нанометров или OD 600 примерно одного.
Адаптация клеток E.coli к дейтерия помечены среды до масштабирования для чрезмерного выражения дейтератированного белка путем разбавления культуры LB от одного до 20 в трех миллилитров минимальной среды. После роста до OD 600 примерно одного, повторите от одного до 20 разбавлений, используя минимальную среду, содержащую 50, 75 и 100%D2O. После адаптации, продолжать расти культуры в биореактор для увеличения урожайности дейтетерированной массы клеток.
По мере увеличения содержания D2O темпы роста будут снижаться. Приступайте к сбору, облысе и очистке клеток, как описано в текстовом протоколе. Далее equilibrate столбец исключения размера с более чем двумя томами столбца окончательного буфера обмена с помощью быстрой белковой жидкой хроматографии системы.
После введения образца запустите столбец в изоляционных фракциях, соответствующих интересного белка. Зарезервировать aliquot соответствует буфер для небольшого угла рассеяния нейтронов или SANS фон вычитания. Для сбора данных SANS сначала загрузите образцы и буферы в кварцевые ячейки.
После обеспечения того, чтобы затвор луча был закрыт, подойди к области среды образца и поместите кварцевые ячейки в смену образца. Завехать положение смены выборки для каждой ячейки образца. Проверьте область и убедитесь, что луч путь свободен от препятствий, прежде чем покинуть область окружающей среды образца.
Затем откройте затвор луча. Выполните сканирование таблицы для автоматического сбора данных. Следуйте инструкциям по эксплуатации приборов, предоставленным ученым по рассеянию нейтронов.
Используйте программное обеспечение Mantid Plot и скрипт Python для уменьшения данных SANS с 2D-изображения до 1D-сюжета. Для этого войдите в кластер удаленного анализа и выполните сюжет Mantid из командной строки. Затем откройте предоставленный скрипт сокращения пользователей и поместите соответствующие номера сканирования или идентификацию для образца в буферные пары в соответствующем списке.
Выполните скрипт для генерации уменьшенных данных в качестве текстового файла с четырьмя столбецами в указанном месте. Право нажмите соответствующее рабочее пространство и mantid участок и выбрать участок с ошибками для первоначального изучения рассеяния профилей. Загрузите набор программного обеспечения ATSAS и используйте PRIMUS для построения данных, масштабирования буфера и вычитания и анализа Guinier.
Запустите приложение ATSAS, SAS для анализа данных и загрузите уменьшенные файлы данных, соответствующие выборке и буферной паре. Чтобы правильно масштабировать буфер, выберите диапазон данных на высоком уровне, где оба профиля похожи по квартире, и нажмите кнопку масштаба, расположенную под вкладкой операций. Увеличьте диапазон данных, чтобы просмотреть все точки, нажмите вычесть для выполнения этой операции.
Выполните анализ данных буфера, вычитаемого из буфера, используя вкладку анализа приложения анализа данных SAS. Убедитесь, что правильный файл выбран в списке и нажмите радиус gyration. Автоматизированная попытка выполнить подгонку Guinier будет предоставлена, нажав на кнопку auto RG.
Расширьте диапазон данных, используемых для включения всех данных с низким уровнем качества, и начните сужать диапазон данных, забирая высокие точки до тех пор, пока максимальная точка RG не будет ниже 1,3. Используйте участок остатков, чтобы убедиться, что данные являются линейными в нужном диапазоне. Внесите небольшие коррективы в подходящий регион и отслеживаем чувствительность этих значений к диапазону данных, используемых в пригонках.
Получить функцию распределения вероятности P R в гноме. Теперь запустите мастер распределения расстояния в вкладке анализа. Получение хорошей подгонки к данным имеет важное значение для получения качественной модели.
Определите Dmax, максимальное межатомное расстояние внутри молекулы. Оцените значение для Dmax, контролируя коробку, чтобы заставить Rmax равен нулю и ввод большого значения для Dmax. Первый X перехват в участке P R дает эту оценку.
Внести дополнительные изменения в это значение Dmax, а также диапазон данных, используемых для количества точек, используемых для оптимизации гнома подходят к данным и в результате P кривой R. Запустите мастер формы PRIMUS с кнопки dammif на вкладке анализа анализа данных SAS и используйте ручной выбор параметров. Определите диапазон Guinier от подгонки и перейти к следующему шагу с помощью кнопок навигации.
Определите значения подгонки из участка P of R и перейти к следующему шагу. Предоставьте параметры процесса моделирования ab initio. Затем инициируют процесс с помощью кнопки коммит.
Наложение и наложение окончательного без конверта с связанной моделью высокого разрешения с использованием supcomb в ATSAS. Поместите копию модели PDB высокого разрешения, чтобы соответствовать конверту SANS в рабочем каталоге. Затем выполните supcomb из командной строки, используя имена файлов PDB в качестве двух аргументов со структурой шаблона, перечисленной в первую очередь.
Наконец визуализировать ab initio результаты модели с помощью PyMOL, 3D молекулярной графики просмотра программы. После того, как оболочка SANS и структура высокого разрешения были наложены, эти модели могут быть визуализированы с помощью любой программы просмотра молекулярной графики. Отображается обзор процесса визуализации PyMOL.
После того, как файлы структуры PDB были открыты в PyMOL, модели должны быть видны в окне просмотра PyMOL. Представления каждой модели могут быть изменены с помощью кнопки S рядом с каждым именем файла. Здесь для оболочки SANS используется представление поверхности, а для белковой основы модели с высоким разрешением используется мультяшное представление.
Подходящая цветовая гамма может быть выбрана из опций, доступных под кнопкой C. Для белковых цепей, цепная окраска обеспечивает градиент цвета от N до C терминуса, чтобы помочь интерпретации. Прозрачность применяется к представлению поверхности, чтобы лучше визуализировать структуру белка в оболочке.
Для публикации изображений рекомендуется белый фон. После того, как эти сигналы визуализации были применены 3D структуры могут быть рассмотрены путем нажатия и перетаскивания структуры. Манипуляции перспективы и вращения молекулы и перевода могут быть выполнены.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы точно соответствовать нейтронный контраст моющего средства головы и хвоста групп с D2O H2O растворителя. После своего развития, эта техника проложила путь для изучения структуры внутримембранных аспарто proteases. Эти белки участвуют в иммунном ответе, гепатите С и болезни Альцгеймера.
Не забывайте, что работа в биохимических лабораториях и на объектах нейтронных лучей может быть опасной. Меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты и следование всем правилам безопасности объекта и радиологические проводки, являются обязательными при выполнении этой процедуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описан протокол исследования физических свойств мембранных белков в растворе с помощью малоуглового нейтронного рассеяния (SANS) на высокопотоковом изотопном реакторе Национальной лаборатории Ок-Ридж. Этот метод особенно подходит для изучения мембранных белков в мицеллах детергентов, что позволяет определять размер, форму, олигомерное состояние и структуру с низким разрешением, сводя к минимуму влияние детергентов. Протокол также включает использование дейтериевого мечения для усиления сигнала белка и представляет собой полный рабочий процесс — от подготовки образцов до анализа и визуализации данных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Биофизика
- Исследование мембранных белков
Теоретические основы
- Мембранные белки сложно изучать из-за их гидрофобной природы и необходимости использования детергентов для поддержания растворимости.
- Традиционные биофизические методы часто с трудом позволяют дифференцировать вклад белка и детергента в комплексах.
- SANS, особенно с использованием дейтериевого мечения, позволяет селективно визуализировать мембранные белки путем подбора рассеивающих свойств детергентов и растворителей.
- Более трети клеточных белков связаны с мембранами, что делает их структурную характеристику крайне важной для понимания многих биологических процессов.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол для характеристики мембранных белков в растворе с помощью SANS.
- Продемонстрировать способы минимизации или исключения влияния детергентов в экспериментах SANS.
- Обеспечить возможность определения олигомерного состояния, формирования комплексов, конформационных изменений, а также процессов сворачивания и разворачивания мембранных белков.
Используемые методы
- Расчет плотности длины рассеяния (SLD) нейтронов с помощью веб-приложения MULCh.
- Экспрессия и адаптация E. coli для получения белков с дейтериевой меткой.
- Очистка белка методом эксклюзионной хроматографии и замена буфера.
- Подготовка образцов и сбор данных SANS с использованием кварцевых кювет и автоматических сменников образцов.
- Обработка и анализ данных с помощью Mantid Plot, пакета программного обеспечения ATSAS (PRIMUS, GNOM, DAMMIF) и визуализация в PyMOL.
Основные результаты
- МАЛС позволяет определять размер, форму и олигомерное состояние мембранных белков в растворе.
- Влияние детергентов может быть эффективно нивелировано, что позволяет проводить четкий анализ белкового компонента.
- Моделирование ab initio и наложение структур с высоким разрешением позволяют получить представление об архитектуре белка.
- Данный протокол обеспечивает визуализацию и получение изображений структур белков внутри конвертов МАЛС, подходящих для публикаций.
Выводы
- SANS в сочетании с дейтериевым мечением является мощным инструментом для структурного анализа мембранных белков в растворе с низким разрешением.
- Данный метод решает ключевые проблемы в исследовании мембранных белков за счет минимизации влияния детергентов.
- Этот подход облегчает изучение олигомеризации белков, конформационной динамики и образования комплексов, имеющих значение для биологических и медицинских исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Малоугловое рассеяние нейтронов (SANS) с использованием детергентов с контрастным согласованием позволяет проводить структурный анализ мембранных белков в растворе с низким разрешением, преодолевая проблему помех со стороны детергентов. Этот подход способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков при поиске лекарственных средств, воздействующих на мембранные белки — критически важный класс, представляющий более одной трети всех клеточных белков. Данный метод повышает точность прогнозирования формирования белковых комплексов, олигомерного состояния и конформационной динамики, что позволяет оптимизировать отбор проектов и принимать решения о дальнейшем продвижении разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать олигомерное состояние и формирование комплексов мембранных белков в условиях, близких к нативным.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет дифференциации белкового сигнала от фона детергента.
- Способствует снижению механистических рисков посредством анализа конформационного состояния и фолдинга.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении мишеней из мембранных белков по этапам разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные белково-детергентные комплексы для последующих биофизических исследований и скрининговых процедур.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные измерения размера и формы белка в растворе.
- Позволяет стандартизировать подготовку образцов и анализ данных в рамках различных проектов.
- Обеспечивает надежную оценку конструкций мембранных белков для разработки анализов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет структурные данные низкого разрешения с системами мембранных белков, связанных с заболеваниями.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации для сложных мембранных мишеней.
- Обосновывает продвижение с учетом рисков, проясняя структурные состояния, имеющие значение для функции.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров в случаях, когда структурные изменения коррелируют с активностью.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод на основе SANS охватывает весь процесс от ранних этапов поиска до идентификации ведущих соединений, обеспечивая возможность повторного использования для структурного анализа мембранных белков.
- Биология открытий: позволяет проверять гипотезы об олигомерном состоянии, формировании комплексов и конформационных изменениях.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для белково-детергентных комплексов.
- Аналитика: предоставляет статистические измерения размера, формы и структурных параметров для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: при наличии подтверждающих данных позволяют перейти от структур с низким разрешением к функциональным исследованиям и изучению механизмов заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый к различным мишеням в виде мембранных белков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях мембранных белков.
- Операционная ценность: Стандартизирует подготовку образцов, сбор и анализ данных для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет раннего уточнения доступности мишени.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию мишеней из числа мембранных белков для дальнейшего продвижения с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области рассеяния нейтронов, дейтериевого маркирования и анализа биофизических данных.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию и аналитической инфраструктуре на нейтронных установках.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и обработки данных.
- Может потребоваться адаптация для различных классов мембранных белков и систем детергентов.
- Ограничено структурными данными низкого разрешения; не подходит для моделирования на атомном уровне.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Determine Neutron Contrast Match Points and Necessary Contrast for Protein Measurement
2:05
Express and Purify the Membrane Protein of Interest
3:25
Collect SANS Data and Reduce SANS Data from 2D Image to 1D Plot
4:48
Analyze Data for Structural Parameters of the Scattering Particle
7:06
Create Ab Initio Models from the SANS Data
8:17
Results: Visualization of the Experimental SANS Envelope and Overlay with High-resolution Model using PyMOL
9:40
Conclusion
