Анализ динамических белковых комплексов монтируется на и освобождены от Biolayer интерферометрии биосенсора с использованием масс-спектрометрии и электронной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за динамической сборкой белковых комплексов в различных pH-средах с помощью биослойной интерферометрии и подтверждении компонентов с помощью электронной микроскопии и масс-спектрометрии. Идентификация и понимание специфики, управляющей формированием и сборкой белковых комплексов, представляет чрезвычайный интерес для биохимических исследователей. Методология, о которой мы говорим сегодня, позволяет исследователям собирать, визуализировать и проверять предсказанные макромолекулярные комплексы.

Сложный характер поверхности биосенсора позволяет исследователям легко высвобождать собранные комплексы в небольшие микрообъемы для электронной микроскопии и масс-спектрометрического анализа. В этой демонстрации мы проследили кинетику pH-индуцированных структурных перестроек комплекса сибирской язвы и верифицировали эти перестройки методами электронной микроскопии и масс-спектрометрии, избегая при этом агрегации. Продемонстрируют сборку токсина сибирской язвы на поверхности биосенсора BLI, высвобождение макрообразцов и процедуры ЭМ-негативного окрашивания Александра Мейчен и Пирс О'Нил, аспиранты моей лаборатории.

Доктор Антонио Артигес играет важную роль в анализе и идентификации микрообразцов, высвобожденных BLI, с помощью масс-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos. Для начала увлажните аминоспособный биосенсорный наконечник BLI второго поколения, погрузив его в 250 микролитров воды, и инкубируйте в течение 10 минут. В программном обеспечении Blitz запрограммируйте время выполнения шага, как указано в этой таблице.

Запустите BLI, погрузив наконечник биосенсора в 250 микролитров воды на 30 секунд, чтобы измерить начальный базовый уровень толщины и плотности биосенсора. Далее активируйте биосенсор, погрузив наконечник в 250 миллилитров 50 миллимолярных NHS и 200 миллимолярных EDC на семь минут. Затем погрузите активированный биосенсор в 50 миллимолярный PDEA, растворенный в буфере из 0,1 молярного бората, pH 8,5, на пять минут для получения активированной биоактивной поверхности.

Теперь погрузите активированный биореактивный биосенсор в 250 микролитров раствора, содержащего 100 наномоляров E126C LFn в 10 миллимолярах ацетата натрия pH пять, 100 миллимоляров буфера хлорида натрия на пять минут. Погрузите наконечник LFn в 50 миллимолярных L-цистеинов, 1 моляр натрия хлорида, 0,1 моляра ацетата натрия pH на четыре минуты, чтобы погасить любые оставшиеся свободные тиол-реакционноспособные группы. После погружения закаленного наконечника LFn в 50 миллимолярный трис, 50 миллимолярный хлорид натрия для создания буферного базового уровня, погрузите наконечник в 0,5 микромолярную защитную антигенную препору, 50 миллимолярный трис, 50 миллимолярный хлорид натрия на пять минут для создания комплекса LFn PA-препор.

После того, как PA-prepore будет связан, удалите наконечник из раствора PA-prepore и погрузите наконечник в 50 миллимолярный трис, 50 миллимолярный хлорид натрия на 30 секунд, чтобы смыть любую неспецифически связанную PA-препору. Погрузите комплекс LFn PA-prepore в 0,5 микроляра CMG2 в 50 миллимоляр Трис, 50 миллимоляр натрия хлорида на пять минут. Погрузите комплекс LFn PA-prepore CMG2 в 50 миллимолярный трис, 50 миллимолярный хлорид натрия на 30 секунд, чтобы смыть любой несвязанный CMG2 и сформировать преэндосомальный комплекс.

Для ЭМ-анализа высвобождайте комплекс LFn PA-prepore CMG2 из наконечника биосенсора, погрузив наконечник в ПЦР-пробирку, содержащую пять микролитров 50 миллимолярного DTT, 50 миллимолярного триса и 50 миллимолярного хлорида натрия. Для тандемного МС-анализа пептидов из комплекса высвобождают комплекс LFn PA-prepore CMG2 из наконечника биосенсора, погружая биосенсор в ПЦР-пробирку, содержащую пять микролитров 50 миллимолярного DTT, шесть моляров гуанидина гидрохлорида и 25 миллимолярного бикарбоната аммония, pH 8. Чтобы просмотреть комплекс после перехода на pH, соберите комплекс LFn PA-prepore CMG2 на биосенсоре, как показано выше.

Погрузите наконечник биосенсора в 10 миллимолярных ацетатов pH на пять минут, чтобы инициировать переход PA-препоры в PA-пору. На этот переход указывает увеличение амплитуды, за которым следует большее снижение амплитуды, которое, как предполагается, является существенным для полной диссоциации рецептора из-за снижения аффинности связывания. Для ЭМ-анализа погрузите наконечник биосенсора в раствор, содержащий 1,25 миллимолярных мицеллы, на пять минут, чтобы предотвратить агрегацию в растворе после высвобождения дисульфида.

Чтобы провести электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием, начните с разрядки медной сетки с углеродным покрытием 300 при стабильном атмосферном давлении 0,38 миллибар и минус 15 миллиампер в течение 20 секунд, а затем протрите устройство воздухом. Закрепите сетку между чистым пинцетом. Затем пипеткой нанесите четыре микролитра высвобожденного сложного образца на сетку и дайте возможность адсорбции в течение 60 секунд.

С помощью клина фильтровальной бумаги смыть остатки жидкости. Затем окрасьте сетку, нанеся на нее пять микролитров 0,75% ноль двух микрон, отфильтрованный уранилформиат, и через пять секунд смойте излишки пятна. Дайте сетке высохнуть при комнатной температуре в закрытом виде.

Затем используйте просвечивающий электронный микроскоп для просмотра образца. Наконец, после подготовки образцов для масс-спектрометрии в соответствии с текстовым протоколом, используйте масс-спектрометр с использованием CID и нормированной энергии столкновения 35 под автоматическим контролем для непрерывного выполнения одного МС-сканирования, за которым следует как можно больше тандемных сканирований МС-МС в течение трехсекундного периода. Сенсограмма BLI представляет собой считывание в режиме реального времени изменений амплитуды из-за специфического добавления компонентов токсина сибирской язвы.

Первый подъем – это нагрузка LFn на вершину. После гашения и исходного уровня PA-препор связывается с LFn, после чего следует добавление растворимого CMG2, в результате чего образуется собранный преэндосомальный комплекс. Затем комплекс подвергается воздействию низкого pH, что ослабляет связывание с рецепторами и приводит к тому, что препоры переходят в свое расширенное поровое подтверждение, которое подтверждается добавлением мицелл.

Здесь представлены ЭМ-изображения с отрицательным окрашиванием комплексов при высвобождении из биосенсора. Преэндосомальные сетки образцов показали плотность, соответствующую интактным тройным комплексам, состоящим из LFn PA-препоры CMG2. Сложные сетки после подкисления показывают, что PA переходит в поры и солюбилизируется включением мицелл без очевидной плотности CMG2.

Как видно из МС, который подтвердил белковые комплексы, преэндосомальные образцы МС содержали пептиды всех трех компонентов токсина с охватом 60,46, 67,97 и 54,15% для LFn, PA и CMG2 соответственно. Постэндосомальные образцы содержали только пептиды из LFn и PA. Недостаток CMG2 согласуется с наблюдаемым снижением BLI в нанометрах при формировании пор. Возможность мониторинга и валидации сборки больших макромолекулярных комплексов является важным шагом на пути к пониманию специфичности и функциональности больших биомолекулярных сборок.

Наша способность высвобождать предварительно собранные высокомолекулярные комплексы из биосенсоров в микрообъемы для визуализации с помощью электронной микроскопии будет чрезвычайно полезна для структурного анализа. При анализе состава сборочных комплексов биосенсоров для идентификации его компонентов до и после ассимилированного эндосомального подкисления использовалось всего 0,04 фемтомола высвобождающего комплекса. Протокол высвобождения биосенсорной сборки может быть адаптирован для отслеживания естественных, но неуловимых pH-индуцированных эндосомальных переходов других бактериальных токсинов в вирусных белковых структурах, с дополнительным бонусом в виде избегания агрегации белков.