Производство и визуализация бактериальный Spheroplasts и протопласта характеризуют антимикробного пептида локализации

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области антимикробных пептидов о том, локализуются ли пептиды в клеточной мембране или перемещаются через нее. Использование сферопластов и протопластов позволяет визуализировать и анализировать локализацию пептидов в физиологически значимой модельной системе без проблем разрешения, возникающих при визуализации бактериальных клеток. Хотя этот метод может дать представление об антимикробных пептидах, он также может быть применен к другим мембранным активным агентам, таким как пептиды, проникающие в клетки.

Грамотрицательные сферопласты E.coli и грамположительные протопласты B.megaterium следует готовить в шкафу биологической безопасности или колпаке с использованием соответствующей стерильной техники. При желании штаммы бактерий могут содержать устойчивую к антибиотикам плазмиду, а сферопласты и протопласты могут быть приготовлены на открытом лабораторном стенде. В этом видео сферопласты и протопласты получают на открытом лабораторном стенде с использованием устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий.

Чтобы создать культуру на ночь, используйте стерильный наконечник микропипетки, чтобы перенести одну бактериальную колонию из твердого агарового планшета в культуральную пробирку объемом 14 миллилитров, содержащую от двух до трех миллилитров трехпроцентного соевого бульона триптиказы, TSB, для 16-21-часовой инкубации при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. Чтобы приготовить грамотрицательные сферопласты E.coli, разведите культуру на ночь в соотношении один к 100, и 25 миллилитров TSB в колбе объемом 250 миллилитров, и верните бактерии в встряхивающий инкубатор еще на 2,5 часа. Когда раствор достигнет оптической плотности от 0,5 до 0,8 при 600 нанометрах, разведите культуру в соотношении один к десяти в свежем TSB в новой колбе объемом 250 миллилитров для второй 2,5-часовой инкубации с конечной эффективной концентрацией 60 микрограммов на миллилитр цефалексина.

Для производства одноклеточных нитей длиной от 50 до 150 микрометров, визуализированных под световым микроскопом при 1000-кратном увеличении. Центрифугируйте бактериальный раствор для сбора нитей и сцеживайте надосадочную жидкость. Промойте нити с аккуратным добавлением одного миллилитра 0,8 моляра сахарозы, стараясь не потревожить гранулы.

Через одну минуту выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, и добавьте указанные реагенты в соответствующем порядке к нитям. Через десять минут при комнатной температуре постепенно добавляйте один миллилитр раствора А в течение одной минуты, осторожно помешивая раствор вручную. Инкубируйте раствор в течение четырех минут при комнатной температуре, затем разделите суспензию нити на две равные аликвоты между двумя 15-миллилитровыми коническими пробирками, содержащими семь миллилитров четырехградусного раствора Цельсия В. Затем оденьте нити путем центрифугирования и с помощью ассириологической пипетки тщательно удалите все, кроме одного-двух миллилитров надосадочной жидкости, не нарушая гранулы.

С помощью микропипетки p1000 аккуратно восстановите суспендию гранул. Проверьте небольшие аликвоты образца на образование сферопластов с помощью световой микроскопии. Затем сферопласты можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение недели или до тех пор, пока они не пройдут три цикла замораживания и оттаивания.

Для приготовления грамположительных протопластов B.megaterium разведите ночную бактериальную культуру в соотношении один к 1000 в 100 мл трехпроцентного TSB в колбе объемом 250 мл для 4,5-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия с встряхиванием. Когда оптическая плотность жидкой культуры достигает от 0,9 до 1,0 на 600 нанометрах, разделите бактерии между двумя коническими пробирками по 50 миллилитров для их центрифугирования и используйте ассириологическую пипетку для воздействия на надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулы в 2,5 миллилитрах протопластовой среды на пробирку и стяните суспензию в одну коническую пробирку для культивирования в колбе объемом 125 миллилитров.

Добавьте в культуру один миллилитр пяти миллиграммов на миллилитр лизоцима для одночасовой инкубации при 37 градусах Цельсия с встряхиванием. Наблюдение за ростом протопласта под световым микроскопом и замечание любых неровностей, таких как бактерии, которые проявляются в виде набухших палочек вместо сфер. По окончании инкубации переложите суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования и повторно суспензируйте гранулу в пяти миллилитрах протопластовой среды.

Затем протопласты можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение недели или до тех пор, пока они не пройдут три цикла замораживания и оттаивания. Для визуализации сферопласта или протопласта перенесите пять микролитров исследуемой суспензии на предметное стекло, покрытое поли-L лизином, а затем два микролитра фитка, меченного 100-200 микромолярным антимикробным пептидом или АМФ. После трехминутной инкубации, защищенной от света, добавьте к образцу один микролитр соответствующей мембранной матрицы для еще трехминутной инкубации в темноте.

В конце инкубации накройте маркированный сферопласт или протопласт стеклянной крышкой, а защитную крышку заклейте лаком для ногтей. Чтобы получить изображение клеток, включите конфокальный микроскоп и соответствующий лазер и выберите объектив с 63-кратным увеличением, затем используйте соответствующее программное обеспечение для визуализации для получения восьмибитных изображений размером 512 на 512 дюймов, состоящих из 0,5-микрометровых срезов всей клетки каждой интересующей бактериальной клетки. Чтобы визуализировать локализацию флуоресцентно меченного АМФ, откройте составные изображения Z-стека в соответствующей программе анализа изображений и найдите самый центральный срез первого сферопласта или протопласта, представляющий интерес.

Поместите одну круглую область интереса диаметром 0,3 микрометра на мембране, одну в центре ячейки и одну в стороне от клетки для измерения фоновой флуоресценции, стараясь избегать насыщенных пикселей. Затем с помощью программного обеспечения можно рассчитать среднюю интенсивность флуоресценции в каждой интересующей области. Пределы разрешающей способности обычных световых микроскопов затрудняют различение, возникают ли сигналы флуоресцентно меченых пептидов из мембраны или из внутриклеточного пространства у нормальных бактерий.

По мере локализации сигналов на мембране будет оказываться наложение на внутриклеточное пространство. Напротив, увеличенный размер сферопласта и протопласта по сравнению с нормальными бактериями приводит к четкому разрешению между мембранным маркером и внутриклеточным пространством. Что облегчает различение пептидной локализации.

Например, локализация на мембране и транслокация через клеточную мембрану флуоресцентно меченного пептида могут быть визуализированы как у сферопласта E.coli, так и у протопласта B.megaterium с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, как показано выше. Размещение интересующих областей на мембране и внутриклеточном пространстве сферопласта или протопласта и на заднем плане, позволяет рассчитать отношение интенсивности внутриклеточной пептидной флуоресценции к интенсивности пептидной флуоресценции на мембране каждого сферопласта или протопласта, взаимодействующего с АМФ. Например, этот метод может быть использован для визуализации взаимодействия мутанта микробного пептида, полученного из гистонов, со сферопластами E.coli и протопластами B.megaterium.

В этом эксперименте АМФ продемонстрировал схожую картину локализации у обоих штаммов бактерий. При этом подчеркивается сниженная транслокация по сравнению с пептидом дикого типа. В конечном счете, этот метод позволяет исследователям исследовать паттерны локализации пептидов на уровне одной клетки.

Дает представление о механизме действия интересующего пептида. В дополнение к тому, что исследователи могут собирать большее количество изображений для систематической характеристики пептидных механизмов, изображения более крупных сферопластов и протопластов лучше поддаются количественному анализу, чем изображения более мелких бактериальных клеток.