Химическая Reversion обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток в наивно как состояние с более мультилинейного дифференциация потенции
10 июня 2018 г.
Мы представляем протокол для эффективной, насыпных и быстрого химического reversion обычных линии загрунтовать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) в epigenomically-stable наивно Предимплантационная Эпибласт как pluripotent состояние. Этот метод приводит к экспрессии генов снижение линии загрунтовать и заметное улучшение направленного дифференцирования мультилинейного через широкий репертуар обычных hPSC линий.
Метод LIF-3i возвращает конвенциональные человеческие плюрипотентные стволовые клетки в более примитивное плюрипотентное состояние с биохимическими, транскрипционными и эпигенетическими характеристиками доимплантатного эпибласта человека. Этот метод улучшает функциональность конвенциональных человеческих плюрипотентных стволовых клеток путем снижения экспрессии генов, ориентированных на линию, и стирания вариабельности между линиями направленной дифференцировки, обычно наблюдаемой среди независимых линий hPSC. Используя этот метод, химически возвращенные человеческие плюрипотентные стволовые клетки сохраняют кариотипическую и эпигенетическую стабильность после продолжительного пассажирования, включая в локусах с импритингом, и могут быть дифференцированы напрямую с повышенной эффективностью без необходимости шага повторного запуска.
Метод LIF-3i откроет новые пути исследования в области ранней биологии развития человека и может продвинуть регенеративную медицину, улучшая дифференцировку человеческих плюрипотентных стволовых клеток, нацеленное нацеливание генов и создание межвидовых химер. Для начала протокола поддерживайте и расширяйте конвенциональные человеческие плюрипотентные стволовые клетки или hPSC с валидированными нормальными кариотипами в сокультурах с мышьими эмбриональными фибробластами или системой культуры на основе МЭФ или в системе культуры без фибробластов. Подготовьте МЭФ-фибробласты на ранее подготовленной желатинизированной шестилуночной пластинке по крайней мере за один день до пассажирования адаптированных к LIF-5i конвенциональных клеток hPSC.
После того как конвенциональные культуры hPSC достигают примерно 50% конфлюэнтности, замените стандартную среду для культуры hESC на два миллитра на луночку среды Leukemia Inhibitory Factor 5i или LIF-5i. Культивируйте и поддерживайте конвенциональные hPSC и МЭФ в течение двух дней в LIF-5i в инкубаторе с CO2. Меняйте среду LIF-5i ежедневно, чтобы адаптировать их для последующего пассажирования и стабильного возвращения в LIF-3i.
Для конвенциональных культур без фибробластов культивируйте hPSC в LIF-5i только ночью перед пассажированием на следующий день. Перед пассажированием промойте адаптированные к LIF-5i конвенциональные клетки hPSC один раз с PBS и добавьте один миллилітр реагента для диссоциации клеток в каждую луночку. Затем инкубируйте пластинку пять минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с CO2.
После инкубации аккуратно перемешайте клетки с помощью пипетки в одноклеточную суспензию. Собирайте клеточную суспензию в среде hESC в по крайней мере двукратном разбавлении в стерильной 15-миллиметровой конусообразной пробирке и аккуратно перемешайте клетки пипеткой, чтобы получить одноклеточную суспензию. Центрифугируйте клетки при 300 g в течение пяти минут.
После центрифугирования аспирировать и выбросить супернатант и ресуспендировать клеточный пеллет в одном-двух миллилитрах среды LIF-5i. Затем подсчитайте клетки. Промойте предварительно посаженную шестилуночную МЭФ-пластинку дважды с двумя миллилитрами PBS на луночку.
Распределите одну-две 10 в шестой степени клеток в двух миллилитрах среды LIF-5i в одну луночку пластинки МЭФ, промотой PBS. Поместите пластинку в инкубатор с CO2. На следующий день аккуратно помешивайте пластинку, чтобы поднять все неприкрепленные клетки, и аспирируйте среду, заменив ее двумя миллилитрами среды LIF-5i.
Повторяйте этот шаг ежедневно в течение трех-пяти дней или пока клетки не достигнут 60-70% конфлюэнтности. Этот протокол поддерживает быстрое и массовое возвращение в наивное подобное состояние широкого спектра человеческих эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, пока подготовки человеческих плюрипотентных стволовых клеток с выраженной дифференцировкой или аномальными кариотипами тщательно исключаются. После первоначальной адаптации к LIF-5i пассажировать последующие стабильные культуры LIF-3i каждые три-четыре дня в био-безопасном шкафу или когда культуры становятся 60-70% конфлюентными.
Отбросьте культуральную среду и промойте каждую луночку культур LIF-5i-LIF-3i, аккуратно добавив два миллитра PBS. Отбросьте PBS и добавьте один миллилітр раствора для отсоединения клеток. Инкубируйте клетки пять минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с CO2.
После инкубации собирайте клеточную суспензию, добавьте необработанную среду hESC в двукратном разбавлении и аккуратно перемешайте клетки пипеткой, чтобы получить одноклеточную суспензию. Перенесите суспензию в стерильную 15-миллиметровую конусообразную пробирку. Центрифугируйте клетки при 300 g в течение пяти минут и аспириру
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Метод LIF-3i позволяет эффективно возвращать обычные человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) в наивное состояние, подобное клеткам преимплантационного эпибласта. Данный протокол расширяет дифференцировочный потенциал и снижает экспрессию генов, определяющих предрасположенность к конкретным клеточным линиям.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Регенеративная медицина
- Биология развития
Теоретические сведения
- Обычные чПСК демонстрируют вариабельность при дифференцировке.
- Наивные плюрипотентные состояния имеют решающее значение для понимания раннего развития.
- Для применения в регенеративной медицине необходимы улучшенные методы дифференцировки.
- Метод LIF-3i позволяет решить эти проблемы.
Цель исследования
- Разработать протокол для возвращения чПСК в наивное состояние.
- Повысить эффективность направленной дифференцировки.
- Снизить межлинейную вариабельность линий чПСК.
Используемые методы
- Сокультивирование с эмбриональными фибробластами мыши (MEF).
- Бесклеточные системы культивирования (без использования фидерного слоя).
- Подготовка шестилуночных планшетов с желатиновым покрытием для фидерного слоя MEF.
- Длительный пассиж ревертированных чПСК для оценки стабильности.
Основные результаты
- Успешный возврат hPSCs в стабильное наивное состояние.
- Наблюдаемое снижение экспрессии генов, определяющих направление дифференцировки.
- Повышение эффективности дифференцировки без повторного прайминга.
- Сохранение кариотипической и эпигеномной стабильности.
Выводы
- Метод LIF-3i открывает новые возможности в биологии развития человека.
- Он может способствовать развитию методов регенеративной медицины.
- Данный протокол может облегчить проведение исследований по таргетингу генов и созданию химер.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол позволяет осуществлять массовый реверс обычных плюрипотентных стволовых клеток человека в наивное состояние, что снижает межлинейную вариабельность результатов дифференцировки и повышает функциональную плюрипотентность. Повышая эффективность дифференцировки без повторного прайминга, этот метод обеспечивает более предсказуемое доклиническое моделирование и снижает риски при валидации мишеней в процессах разработки препаратов для регенеративной медицины. Воспроизводимость данного метода на различных линиях hESC и бестрансгенных линиях hiPSC способствует созданию масштабируемых стандартизированных рабочих процессов для ранних этапов поиска и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем возвращения hPSC, имеющих предрасположенность к определенной линии, в более раннее состояние развития с пониженным уровнем эпигенетического шума.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней с использованием изогенных сравнений между наивным и праймированным состояниями для выяснения механизма действия.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность анализов дифференцировки за счет минимизации межлинейной вариабельности, которая затрудняет идентификацию перспективных соединений.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность к анализу: позволяет получать стабильные, кариотипически нормальные наивные hPSC, подходящие для платформ высокопроизводительного скрининга, требующих согласованных клеточных ответов.
- Количественный выход: обеспечивает измеримую эффективность дифференцировки по всем зародышевым листкам, что позволяет проводить надежный скрининг фенотипов и анализ зависимости «доза-эффект».
- Масштабируемость: позволяет осуществлять массовую реверсию без клонального отбора, что способствует подготовке крупномасштабных анализов и проведению кампаний по скринингу реагентов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: обеспечивает создание developmentally accurate системы, имитирующей человеческий преимплантационный эпибласт, для моделирования нарушений раннего развития.
- Трансляционная преемственность: поддерживает эпигеномную стабильность в импринтированных локусах, что позволяет достоверно экстраполировать результаты на дифференцировку in vivo и формирование тератом.
- Снижение механических рисков: устраняет межлинейную вариабельность при направленной дифференцировке, сокращая количество ложноотрицательных и ложноположительных результатов в доклинических исследованиях эффективности.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Последовательный метод перехода от LIF-5i к LIF-3i интегрируется в исследовательские рабочие процессы, обеспечивая стандартизированное получение клеток в наивном состоянии перед проведением анализов на дифференцировку, этапами идентификации перспективных соединений и стадиями доклинической валидации.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез с помощью изогенных сравнений наивного и праймированного состояний чПСК для выяснения механизмов действия мишеней и зависимостей путей.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые, способные к дифференцировке популяции клеток для стандартизации анализов и скрининга соединений с пониженной вариабельностью между лунками.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку эффективности трилинейной дифференцировки и нормализацию экспрессии генов для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Поддерживает эпигеномную и кариотипическую стабильность при длительном пассировании, что способствует проведению лонгитюдных доклинических исследований и согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает обратимый, платформенно-независимый метод получения наивных чПСК для нескольких проектов и клеточных линий, сокращая необходимость в избыточной оптимизации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозирования результатов дифференцировки за счет снижения сигналинга, предрасполагающего к определенным линиям, и повышения стабильности плюрипотентности.
- Практическая ценность: Стандартизированный протокол, совместимый с использованием фидерного слоя или без него, с минимальным количеством манипуляций и высокой воспроизводимостью в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшего развития проекта (go/no-go) путем минимизации биологического шума в анализах дифференцировки, что снижает риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию клеточных линий с учетом рисков на основе их способности к функциональному сбросу, а не вариабельности генетического фона.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, включая пассирование, диссоциацию и валидацию маркеров плюрипотентности.
- Необходимы CO2-инкубатор, бокс биологической безопасности и стандартное оборудование для культивирования клеток для совместного культивирования с MEF или адаптации в бесфидерных условиях.
- Требуется стандартизированный состав среды, включающий LIF, ингибиторы GSK3β и MEK/ERK, а также ингибитор танкиразы XAV939 для LIF-3i, с возможным добавлением форсколина и пурморфамина для адаптации к LIF-5i.
- Для обеспечения успешной реверсии необходима валидация нормального кариотипа и низкого уровня спонтанной дифференцировки в исходных линиях hPSC.
- Адаптация в различных модельных системах может потребовать оптимизации начальной плотности посева и продолжительности воздействия LIF-5i для клональной экспансии.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Bulk Stabilization of Conventional hPSC Cultures for Subsequent Naïve Reversion with a Brief LIF-5i Adaptation
4:38
Long-term Maintenance and Expansion of N-hPSC in LIF-3i Medium
7:14
Results: Effective Reversion of Human Pluripotent Stem Cells
7:47
Conclusion
