Носовые разности потенциалов для количественного определения транс эпителиальных ионный транспорт в мышей
4 июля 2018 г.
Здесь мы представляем протокол для измерения носовой разности потенциалов в мышах. Тест дает количественную оценку функции трансмембранных ионных транспортеров как регулятор трансмембранной проводимости кистозный фиброз и эпителиальных натриевых каналов. Это ценно для оценки эффективности новых терапий для муковисцидоз.
Разность носовых потенциалов является ценным методом для характеристики фенотипа трансгенных мышей, моделирующих муковисцидоз. Это позволяет исследовать эффективность новых видов лечения муковисцидоза. Основные преимущества метода заключаются в том, что он обеспечивает надежные измерения у непрерывно размножающихся мышей.
Это снижает связанную с этим смертность и позволяет повторить испытание на том же животном. Чтобы подготовить носовой катетер с двойным просветом, подержите середину полиэтиленовой трубки длиной 20 сантиметров в пламени от 10 до 15 секунд, пока она не станет достаточно мягкой для вытягивания. Затем раздвиньте два конца, чтобы получить очень тонкую капиллярную трубку длиной около 15 сантиметров и внешним диаметром 0,1 миллиметра для носового зонда.
После этого очистите и обезжирьте два капилляра чистым этанолом. Соедините их скотчем и склейте вместе с помощью цианоакрилатного клея. Срежьте лишнюю длину зондов бритвенным лезвием, чтобы получить двухпросветный катетер длиной около восьми сантиметров.
Затем введите воду через оба просвета, чтобы убедиться, что они проницаемы, и сделайте отметку на расстоянии пяти миллиметров от кончика. Впоследствии приготовьте кремовую смесь, смешав электролит крема и насыщенный раствор трех моляров калия в соотношении один к одному, не допуская образования мельчайших пузырьков воздуха. Для экспериментальной установки, чтобы предотвратить переохлаждение во время и после теста, используйте две грелки, одну для измерительной установки, а другую для коробки, в которую животное будет помещено для восстановления в конце теста.
Включите компьютер, к которому подключены данные с высоким входным сопротивлением и высоким разрешением вольтметра. Затем откройте программу для сбора данных. Подключите электроды к вольтметру.
Окуните кончики электродов вместе в кремовую смесь. Проверьте начальное значение смещения электрода и отбракуйте электроды, если значение больше плюс-минус двух милливольт. Затем включите перистальтическую помпу и вставьте трубку насоса в перфузирующий просвет носового катетера.
Заполните один просвет носового катетера электролитным кремом, смешайте через наконечник пипетки объемом 10 микролитров. Подогните катетер к соединителю силиконовой трубки и заполните соединитель сливочной смесью. После этого вставьте положительный электрод в разъем.
Проверьте значение смещения моста измерительного электрода и отбракуйте мосты, если значение больше плюс-минус двух милливольт. Впоследствии подсоедините проксимальный выход трубки насоса к флакону, содержащему выбранный раствор для перфузии носа. Затем подсоедините дистальный выход трубки насоса к перфузионному просвету носового катетера.
Далее заполните второй просвет носового катетера свежим раствором А1. Опустите кончик носового катетера во флакон с раствором А. Измените направление перистальтического насоса, чтобы заполнить длину носового катетера, соответствующую 10 секундам перфузии. Впоследствии сложите лист впитывающей ткани, чтобы получилась подушка шириной три сантиметра, которая будет использоваться в качестве опоры для головы мыши. Накройте грелку листом впитывающей салфетки.
Затем положите мышь на спину на грелку, а конечности и хвост примотайте к подушечке. После этого введите референтный внутривенный катетер в подкожное пространство задней конечности. Извлеките иглу и приспособьте к соединителю силиконовой трубки.
Заполните катетер и соединитель кремовой смесью. Далее подсоедините положительный измерительный электрод к носовому катетеру, а отрицательный электрод сравнения к катетеру, вводимому в подкожное пространство в задней конечности животного. Затем зафиксируйте катетер и электрод лентой по мере необходимости, чтобы предотвратить смещение.
После установки электрода сравнения и мостов еще раз проверьте значение смещения моста измерительного электрода, погрузив кончик носового катетера в смесь электродного крема внутри разъема внутривенного катетера. Запишите стабильное, окончательное значение смещения. Теперь зафиксируйте ушки мыши скотчем на грелке в свободном пространстве между двумя кусочками впитывающей ткани.
Фиксируйте яркость, не касаясь глаз. Чтобы впитать жидкость из ротовой полости, переместите язык в сторону и вставьте в рот заостренный фитиль фильтровальной бумаги на расстоянии около одного сантиметра. Чтобы впитать жидкость, вытекающую из перфузированной ноздри, приложите второй лист фильтровальной бумаги к носу.
Проверьте значение положительного контроля эпителиального потенциала, поместив кончик носового катетера внутрь рта. Удерживая его тонкими щипцами и при хорошем прямом освещении, осторожно введите носовой катетер в одну ноздрю, на расстоянии от четырех до шести миллиметров от кончика носа. Через пять минут после введения обезболивающих препаратов аккуратно наклоните грелку примерно на 30 градусов головой животного вниз.
Контролируйте максимальное базальное значение PD. Когда она стабилизируется в течение 30 секунд, начните перфузию слизистой оболочки носа со скоростью 10 микролитров в минуту четырьмя буферными растворами подряд. Перфузируйте первый раствор в течение 10 секунд, а каждый последующий раствор в течение пяти минут, или до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное напряжение.
Прекратите перфузию Форсколина, когда переходная реакция Форсколина начнет снижаться. После оценки освободите мышь от грелки. Введите его вместе со смесью антагонистов анестетика и перенесите в бокс для восстановления с грелкой до полного восстановления.
Ниже приведены репрезентативные носовые БП гомозиготной, нормальной мыши и мыши, гомозиготной по мутации CFTR делеции F508, а также индивидуальные значения, полученные для назальных параметров БД. Амилоридный ответ представляет собой разницу между значениями назального ПД в конце и в начале перфузии слизистой оболочки носа базальным буферным раствором соли, содержащим амилорид. Бесхлоридный ответ представляет собой разницу между значениями назального ПД в конце и в начале перфузии слизистой оболочки носа бесхлоридным буферным раствором соли плюс амилорид.
Реакция Форсколина представляет собой разницу между значениями назального ПД в конце и в начале перфузии слизистой оболочки носа раствором свободной хлоридной буферизованной соли, плюс Форсколин и амилорид. Общая реакция хлорида представляет собой сумму двух последних параметров, полученных при нулевой перфузии хлорида. Проект может быть использован для исследования, обеспечения транспортировки перебежчиков в мыши, а также в собачке, в большой и в модели муковисцидоза хорька.
И транспортировщики натрия в модели мыши евнуха. Все транспортеры могут быть изучены путем принятия протокола. Работа в носовой полости грызунов чрезвычайно деликатна из-за существенной стенки сенсорных входов из носовой лицевой области.
Адекватная смерть анестезии особенно затруднена при операциях в носовой полости мыши.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол измерения разности потенциалов в полости носа у мышей, который позволяет количественно оценить функцию трансмембранных ионных транспортеров. Этот метод особенно полезен для оценки новых методов терапии муковисцидоза.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Трансгенные модели
Теоретические сведения
- Измерение разности потенциалов в носовой полости является методом характеристики трансгенных мышей.
- Этот метод помогает оценить эффективность новых способов терапии муковисцидоза.
- Данная техника преимущественна для мышей, находящихся в непрерывном разведении.
- Она сводит к минимуму сопутствующую смертность и позволяет проводить повторное тестирование одного и того же животного.
Цель исследования
- Для измерения разности потенциалов в носовой полости мышей.
- Для оценки функции ионных транспортеров, таких как CFTR и ENaC.
- Для оценки эффективности новых методов лечения муковисцидоза.
Используемые методы
- Подготовка двухпросветного назального катетера.
- Измерение разности назальных потенциалов у трансгенных мышей.
- Оценка функции ионных транспортеров.
- Оценка эффективности терапии.
Основные результаты
- Получение надежных результатов измерений при использовании мышей в условиях непрерывного разведения.
- Снижение смертности, связанной с процедурами тестирования.
- Возможность повторного проведения тестов на одном и том же животном.
- Понимание эффективности новых методов терапии муковисцидоза.
Выводы
- Измерение разности потенциалов слизистой оболочки носа является ценным методом исследования муковисцидоза.
- Данный протокол повышает достоверность измерений на моделях мышей.
- Этот метод способствует разработке новых терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Измерение назального потенциала (NPD) у мышей обеспечивает функциональный анализ трансэпителиального транспорта ионов, что позволяет проводить доклиническую оценку препаратов для лечения муковисцидоза (CF). Количественное определение активности CFTR и ENaC in vivo поддерживает валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах разработки. Повторное тестирование одного и того же животного снижает вариабельность и повышает прогностическую достоверность при принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки терапии муковисцидоза.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения функционального транспорта хлоридов и натрия на моделях мышей с муковисцидозом.
- Практическая ценность: обеспечивает биологическое снижение рисков при разработке модуляторов CFTR посредством прямого фенотипирования ионного транспорта.
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования за счет дифференциации фенотипов муковисцидоза и дикого типа на основании ответов на амилорид, безхлоридные условия и форсколин.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для стандартизации анализа с использованием двухпросветных назальных катетеров и контролируемой перфузии.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимости за счет проверки стабильного смещения электрода и соблюдения протоколов постоянной перфузии растворов.
- Научная ценность: Обеспечение надежной оценки соединений путем измерения ответов ионных транспортеров на растворы амилорида, безхлоридные растворы и растворы форсколина.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет сохранить релевантность модели заболевания путем количественной оценки функциональных дефектов транспортеров CFTR и ENaC у мышей со спонтанным дыханием.
- Практическая ценность: поддерживает трансляционную преемственность, позволяя проводить несколько тестов на одном животном, что снижает межиндивидуальную вариабельность.
- Научная ценность: обосновывает решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, предоставляя количественные графики фармакодинамики (PD), которые коррелируют с генотипом.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод NPD интегрируется в цикл разработки лекарственных средств — от валидации мишени до доклинической оценки, предоставляя функциональные данные о транспорте ионов, которые используются для оценки терапевтической эффективности.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы путем измерения базального и стимулированного разности потенциалов слизистой оболочки носа у трансгенных мышей.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной перфузии буферных растворов и получения стабильных показателей напряжения.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения зависимых переменных (ответ на амилорид, ответ в отсутствие хлорида, ответ на форсколин, общий хлоридный ответ) для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность доклинических исследований, позволяя проводить повторные тесты на одном и том же животном для мониторинга долгосрочных эффектов лечения.
- Корпоративное повторное использование: служит универсальным методом для характеристики моделей муковисцидоза (CF) в рамках нескольких итераций терапевтического исследования.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозирования валидации мишеней посредством количественного фенотипирования транспорта ионов.
- Операционная ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости за счет подготовки катетеров, калибровки электродов и контроля перфузии.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем снижения механистической неопределенности при оценке эффективности модуляторов CFTR и ENaC.
- Влияние на портфель: Приоритезация с учетом рисков на основе коррекции функционального дефекта транспорта в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Опыт в области применения анестезии у грызунов и техники установки назального катетера.
- Оборудование, включая вольтметр с высоким входным сопротивлением, перистальтический насос и нагревательные маты с контролем температуры.
- Межгрупповая стандартизация приготовления растворов, проверки смещения электрода и времени перфузии.
- Особенности адаптации для различных линий грызунов и моделей мутаций CFTR.
- Практические ограничения включают хирургическую сложность доступа к полости носа и оптимизацию глубины анестезии для предотвращения бронхоаспирации.
