Экспериментальный протокол для изучения поведенческих реакции профили в личинок рыб: Приложение к кофеину нейро стимулятор
July 24th, 2018
Здесь мы представляем протокол для изучения личиночной данио рерио и толстоголового гольян опорно-двигательной деятельности и photomotor реакции (PMR) с помощью автоматического отслеживания программного обеспечения. Когда включены в общей токсикологии bioassays, анализ этих поведений обеспечивают диагностический инструмент для изучения химические препараты. Этот Протокол описан с помощью кофеин, модель neurostimulant.
Модели рыб имеют множество преимуществ и впоследствии все чаще используются в биомедицинских науках. От разработки до открытия лекарств и токсикологических исследований. Поведение моделей рыб также все чаще используется в экологических и биомедицинских исследованиях.
Здесь особенно важно использовать многолетний опыт исследований в области водной токсикологии и поведенческой экологии для развития экологических биомедицинских наук. Наш метод может быть использован для понимания биоагрессивности химических веществ, а также преимуществ и опасностей, которые они могут представлять. Основным преимуществом этого протокола является то, что он обеспечивает чуткий и быстрый подход к диагностическому пониманию химических активностей, полезных для экологических и биомедицинских наук.
Применение этого метода призвано поддержать диагностику коммерческих биоавтивностей и поведенческих эффектов. В большинстве этих химических веществ часто отсутствует важная информация о токсичности. Тем не менее, его также можно применять для понимания воздействия других химических веществ, таких как фармацевтические препараты и пестициды.
Этот аспект важно учитывать, поскольку сравнительные данные по экологической фармакологии и токсикологии для промышленных соединений часто отсутствуют. В дополнение к измерению локомоторной активности личинок во время изменяющихся светлых и темных фотопериодов, этот протокол может быть использован для измерения фотомоторных реакций личинок. Которые эффективно исследуют величину разницы движений между переходами от светлого к темному и от темного к светлому.
Для начала растворите кофеин в восстановленной жесткой воде. Затем выполните серийные разведения для снижения уровня кофеина. Для приготовления отдельных экспонирующих камер налейте 20 миллилитров раствора в четыре стеклянных стакана по 100 миллилитров для рыбок данио
.Налейте 200 миллилитров раствора в три стеклянных стакана по 500 миллилитров для толстоголовых пескарей. Затем с помощью пипетки для переноса поместите 10 эмбрионов данио-рерио в возрасте от четырех до шести часов после оплодотворения в каждый из стаканов. С помощью модифицированной передаточной пипетки поместите в каждую из экспозиционных камер по 10 личинок толстоголового гольяна, достигших возраста в течение 24 часов после вылупления.
Поместите камеру данио-рерио и толстоголового гольяна в инкубатор. Через 96 часов загрузите отдельных рыб в отдельные лунки на 48 и 24 лунки. Поместите в камеру записи лунку с хотя бы одной личинкой рыбы.
Затем в программном обеспечении для отслеживания видео нажмите Протокол генерации файла. В поле подсчета местоположений диалогового окна введите количество отдельных скважин пластины скважины. И нажмите OK.At верхней части экрана, нажмите «Просмотр на весь экран».
Отображение вида с камеры сверху на пластину скважины. Затем нажмите на иконку областей рисования. Выберите значок круга в поле с надписями.
С помощью курсора очертите круглую область слежения за видео в верхнем левом углублении пластины. Выберите отметку в правом верхнем углу и обведите область просмотра в правом верхнем углублении. Затем выберите нижнюю отметку, чтобы обвести нижнюю правую лунку.
После определения областей слежения за скважиной нажмите кнопку «Построить», чтобы предложить программному обеспечению очертить области обзора оставшихся скважин. В области калибровки нажмите кнопку Нарисовать шкалу и нарисуйте горизонтальную линию поперек пластины. Как только линия будет нарисована, появится диалоговое окно с надписью «Калибровочное измерение».
Введите длину пластины лунки в это поле и нажмите OK. Нажмите «Применить» к группе в области калибровки. Чтобы выйти из диспетчера рисования, нажмите на значок областей рисования. Далее нажмите на иконку плитки.
С помощью курсора выделите все поля, которые появляются на экране просмотра так, чтобы каждое поле было зеленым. Нажмите «Просмотр» и перейдите на весь экран. Затем в поле порога обнаружения нажмите bkg и используйте панель настройки порога, чтобы установить порог обнаружения пикселей.
После выбора соответствующего порога нажмите кнопку Применить к группе. В поле с надписью порог движения введите желаемые параметры отслеживания скорости движения. После того, как параметры скорости установлены, нажмите «Применить к группе».
Далее нажмите «Параметры протокола» в выпадающем меню. В диалоговом окне выберите вкладку времени и введите время наблюдения и интегрирования. Нажмите OK и откройте диалоговое окно настроек светофорного драйвера, выбрав светошум из выпадающего меню параметров.
Установите светлый, темный, период, время и интенсивность света для каждого периода фотографии. Затем нажмите OK. Далее сохраните протокол наблюдения.
Сначала поместите планшет с экспериментальной рыбой в камеру регистрации поведения. Затем откройте ранее разработанный протокол отслеживания. В просмотрщике видеослежения убедитесь, что все личинки видны, что в каждой лунке присутствует только одна личинка и что лунки выровнены с определенными зонами наблюдения.
Далее нажмите на кнопку «Экспериментировать» и выполните задание. Укажите название и место сохранения данных. И нажмите на значок нескольких живых изображений, чтобы выделить все предопределенные области просмотра.
Наконец, закройте панель записывающей камеры и нажмите фон, а затем запустите на мониторе компьютера. После 96 часов воздействия кофеина у личинок толстоголового гольяна фотомоторная реакция была изменена кофеином в более низких концентрациях, чем у рыбок данио. Тем не менее, у рыбок данио было затронуто заметно большее количество конечных точек фотомотора.
Кроме того, светлая и темная локомоторная активность была проанализирована по трем пороговым значениям скорости для расстояния перемещения, количества движений и продолжительности движений. У обоих видов кофеин подавлял активность во всех значимых локомоторных конечных точках. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что поведенческие анализы должны быть связаны с узким определенным временным окном.
Потому что время суток может влиять на поведение личинок рыб. Следуя этой процедуре, методы могут быть применены к стандартизированным рекомендациям по другим химическим веществам, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с поведением рыб. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как наблюдать за поведением и фотомоторными реакциями моделей личинок рыб при проведении биотестов на токсичность с помощью стандартизированных рекомендаций, имеющих отношение к экологическим и биомедицинским наукам.
Не забывайте, что работа с определенными химическими веществами может быть опасной, поэтому обязательно надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты при выполнении этого протокола.
Обзор
В данной статье представлен протокол для исследования локомоторной активности и фотомоторных реакций личинок данио и минога с тонкой головой с помощью автоматизированного программного обеспечения для отслеживания. Метод направлен на улучшение токсикологических биотестов, обеспечивая представление о химической биоактивности, что продемонстрировано на примере использования кофеина в качестве модельного нейростимулирующего средства.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Поведенческая экология
- Токсикология водных объектов
- Биомедицинские исследования
Фон
- Модель рыб все чаще используется в биомедицинских науках.
- Поведенческие исследования на рыбах могут дать информацию для исследований в области окружающей среды и биомедицины.
- Понимание химической биоактивности важно для оценки их преимуществ и опасностей.
- Сравнительные данные по фармакологии и токсикологии окружающей среды часто отсутствуют.
Цель исследования
- Разработать чувствительный и быстрый метод оценки химической активности.
- Поддержать диагностику коммерческой биоактивности и поведенческих эффектов.
- Предоставить стандартизированный подход для оценки воздействия различных химикатов.
Используемые методы
- Растворяемость кофеина в жесткой воде для воздействия.
- Использование автоматизированного программного обеспечения для анализа локомоторных и фотомоторных реакций.
- Проведение серийных разбавлений для оценки различных концентраций кофеина.
- Мониторинг поведения личинок рыб в течение светового и темного циклов.
Основные результаты
- Кофеин изменял фотомоторные реакции у минога с тонкой головой на более низких уровнях, чем у данио.
- У данио наблюдалось большее количество пораженных фотомоторных конечных точек.
- Обе группы рыб проявляли угнетенную активность по всем локомоторным конечным точкам.
- Время суток значительно влияет на поведение личинок рыб во время исследований.
Выводы
- Протокол предоставляет рамки для оценки поведенческих эффектов химикатов.
- Методы могут быть стандартизированы для других химикатов для исследования дополнительных вопросов.
- Данный подход улучшает понимание поведения рыб в токсикологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid behavioral profiling of larval fish to assess neuroactive compound effects, supporting early-stage target validation in neuropharmacology. By quantifying photomotor and locomotor responses, it provides mechanistic insights that aid in de-risking CNS-active compounds before mammalian testing. The comparative sensitivity between zebrafish and fathead minnows offers a translational advantage for species-specific behavioral screening in environmental and biomedical contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring neurostimulant-induced behavioral changes in larval fish models.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantifiable photomotor and locomotor endpoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with significant behavioral effects at environmentally relevant concentrations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated behavioral assays for downstream compound screening using automated tracking.
- Quantitative Outputs: Generates measurable locomotor and photomotor data across speed thresholds for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardizes light/dark cycle protocols to ensure consistent behavioral readouts across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neuropharmacological responses relevant to CNS disorder target engagement.
- Translational Continuity: Bridges behavioral ecotoxicology with biomedical screening through conserved behavioral endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by highlighting species-specific sensitivity differences in neuroactive compound responses.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing and lead identification through behavioral phenotyping of larval fish exposed to neuroactive compounds.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking compound exposure to altered photomotor and locomotor behaviors.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible behavioral readouts for compound effect comparison.
- Analytics: Provides quantitative movement thresholds and photomotor response metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects behavioral ecotoxicology to preclinical neuropharmacology via conserved behavioral assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable behavioral profiling platform applicable to diverse chemical libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuroactive compound screening.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of behavioral assays across species and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS-active compounds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization based on quantitative behavioral effect thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in larval fish husbandry and behavioral tracking software operation.
- Dependent on automated video tracking systems and controlled environmental incubators.
- Necessitates cross-team standardization of exposure protocols and behavioral endpoint definitions.
- Must account for diurnal behavioral variability when scheduling assays.
- Limited to behavioral endpoints; does not replace mechanistic or molecular target validation.
