Изоляция артериол сетчатки для исследования физиологии клетки Ex Vivo

Эта рукопись описывает простой протокол для изоляции артериол от сетчатки крыс, который может использоваться в электрофизиологических, кальция изображений и давления миография исследований.

Понимание того, как контролируется кровоток в сетчатке, является важной целью, поскольку аномальный кровоток связан с развитием различных угрожающих зрению заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия, глаукома и окклюзия ветвей вен. Артериолы сетчатки играют ключевую роль в регуляции кровотока в сетчатке, расширяя и сужая диаметр их просвета, что опосредовано изменениями сократительной способности гладкомышечных клеток, окружающих эти сосуды. Таким образом, понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции перфузии сетчатки, требует подготовки, при которой клетки артериол сетчатки могут быть доступны и изучены в условиях, максимально приближенных к физиологическим.

В этом видео мы демонстрируем простой протокол выделения артериол из сетчатки крысы, который можно использовать при наложении пластыря, визуализации кальция и исследованиях миографии под давлением. В течение последних нескольких лет этот препарат использовался для получения более глубокого понимания регуляции сократительной способности гладких мышц сосудов и кровотока в сетчатке как у здоровья, так и у больных. Составьте один литр раствора с низким содержанием кальция, содержащего Hanks' или LCH, как показано в таблице материалов.

Соберите изолирующее оборудование перед сбором ткани. Стеклянная пипетка Пастера должна быть отполирована огнём до гладкости, но не сужения кончика. Обрежьте пластиковую пипетку до отверстия примерно в пять-семь миллиметров.

Поместите глаза на препарирующую чашку, погруженную в раствор LCH. Используйте один набор щипцов, чтобы прикрепить глаз к чашке, удерживая прикрепления орбитальных мышц или зрительного нерва. Убедитесь, что точка крепления находится как можно ближе к склере, чтобы стабилизировать глаз.

С помощью лезвия разрежьте роговицу вдоль ora пильчатой мышцы, и снимите линзу, аккуратно надавливая на склеры щипцами. Маленькая круглая область, которую мы видим в задней части глаза на этом изображении, — это зрительный нерв. С помощью лезвия разрежьте наглазник пополам симметрично через диск зрительного нерва.

С помощью закрытых щипцов аккуратно вычистите сетчатку с двух половин наглазника, стараясь удалить все оставшиеся насадки на диске зрительного нерва. Повторите процесс со вторым глазом и перенесите рассеченную сетчатку в пробирку с помощью пластиковой пипетки и небольшой капли среды LCH. С помощью пластиковой пипетки наполните пробирку LCH примерно до пяти миллилитров и дайте сетчатке осесть на дно пробирки.

Промойте салфетку примерно три раза, удалив примерно четыре миллилитра раствора из пробирки и добавив свежий ЛЖК с помощью пластиковой пипетки. При необходимости следует удалить посторонние ткани. Промойте внутреннюю часть стеклянной пипетки Пастера с полированным наконечником с помощью LCH, чтобы предотвратить прилипание ткани к пипетке.

С помощью той же пипетки извлеките из пробирки примерно четыре миллилитра раствора, и добавьте примерно два миллилитра свежего ЛЖК. Аккуратно диссоциируйте сетчатку, медленно протягивая ткань через кончик стеклянной пипетки, и выдавите содержимое в пробирку. Старайтесь не вводить пузырьки на этом этапе и повторяйте процесс до тех пор, пока сетчатка не разорвется до размера примерно двух-трех квадратных миллиметров.

Промойте внутреннюю часть пипетки примерно двумя миллилитрами LCH и выдавите его в пробирку. Дайте содержимому осесть на дно в течение пяти-10 минут. Повторите процесс растирания, как описано ранее, с немного большим усилием, пока размер кусочков ткани не достигнет примерно одного квадратного миллиметра.

Дайте ткани осесть и повторите еще раз с еще большей силой, пока содержимое не станет полностью гомогенизированным и не останется кусочков сетчатки. Раствор на этом этапе должен казаться молочного цвета на вид. Этот метод позволит получить до восьми артериольных сегментов на одну изоляцию размером от 200 до 2500 микрометров в длину.

Канюляция одного конца артериолы с окклюзией противоположного конца позволяет измерить индуцированную давлением вазоконстрикцию, также известную как миогенная реакция. Миография артериального давления проводится следующим образом. Аликвота гомогената сетчатки переносится в физиологическую регистрирующую камеру, установленную на предметном столике инвертированного микроскопа.

Оставьте гомогенат осесть на дне камеры не менее чем на пять минут. Визуальное сканирование камеры записи для выявления артериол длиной более 200 микрометров и с открытым концом, через который можно канюлировать сосуд. Встаньте на якорь с одного конца судна с помощью тонких щипцов и небольшого налипа из вольфрамовой проволоки, помещенного над судном.

Используя перекрывающиеся концы вольфрамовой проволоки, маневрируйте сосудом так, чтобы он проходил горизонтально поперек ванны таким образом, чтобы открытый конец находился на одной линии с канюлей наддува. Перфузируйте камеру с нулевым содержанием кальция при температуре 37 градусов Цельсия. Канюляция проводится стеклянными пипетками.

Канюля располагается на открытом конце сосуда с помощью тонкого микроманипулятора. Наконечник расположен непосредственно рядом с отверстием, что оценивается путем регулировки плоскости фокусировки на микроскопе таким образом, чтобы конец сосуда и кончик канюли находились в фокусе одновременно, а канюля под давлением продвигалась в отверстие сосуда. Вспомогательная пипетка необходима для помощи в процессе канюляции и используется для мягкого удержания артериолы и направления артериолярной стенки через канюлю под давлением в то же время, когда канюля продвигается в просвет сосуда.

Эта процедура требует одновременного, контролируемого движения обоих манипуляторов и обширной практики для достижения высокого уровня успеха. После одной минуты регистрации при нуле миллиметров ртутного столба внутрипросветное давление повышается до 40 миллиметров ртутного столба, и сосуд должен быстро расширяться, подтверждая успешную канюляцию. Индуцированная давлением вазоконстрикция, то есть миогенная реакция, будет развиваться в течение примерно 15 минут.

Запись патч-хомута из гладкомышечных клеток сосудов сетчатки позволяет исследовать ионные токи плазматической мембраны, которые регулируют внутриклеточный кальций и, следовательно, клеточную сократимость. Полноклеточная и одноканальная запись возможна из отдельных гладкомышечных клеток, все еще встроенных в их родительские артериолы, следующим образом. Артериолы сетчатки изолированы и закреплены в записывающей камере с помощью вольфрамовых проволочных пластинок.

Базальная пластинка должна быть удалена, чтобы между патч-пипеткой и мембраной артериоларных гладкомышечных клеток образовалось высокопрочное уплотнение. Артериолы суперфингируются с последовательным рядом растворов ферментов при 37 градусах Цельсия, что также приводит к электрическому разъединению соседних клеток, как показано стрелками на изображении. Уровень пищеварения первоначально оценивается по визуальному разделению эндотелиальных и гладких мышечных слоев на этапе коллагеназы.

Удаление любых оставшихся нитей базальной пластинки и/или периферической нейропилы достигается путем тщательного сметания закрытых кончиков тонких щипцов вдоль поверхности сосуда. Для зажима пластыря кончик патч-пипетки располагается вертикально над исследуемой клеткой и постепенно опускается с помощью тонкого и медленного движения микроманипулятора для контакта с мембраной гладких мышц артериолы. Об этом судят по движению клеток и изменению сопротивления пипетки, измеренному с помощью протокола тестирования герметичности клеток в программном обеспечении для сбора данных.

По мере опускания пипетки на ячейку сопротивление уплотнения увеличивается примерно в пять раз. Отрицательное давление временно прикладывается к тыльной стороне пипетки, и постепенно формируется гигасил. Это требует многократного применения отрицательного давления в течение от одной до пяти минут.

Для записи целых клеток преимущественно используется метод перфорированного патч-зажима. Гигапечать формируют, как описано ранее, с помощью пипетки, содержащей внутриклеточный раствор и амфотерицин В. Сопротивление доступа контролируется с помощью протокола тестирования мембраны в программном обеспечении для сбора данных. Как только сопротивление доступа падает до менее чем 15 МОм, выполняется последовательная компенсация сопротивления.

Как правило, в режиме перфорированного патча можно компенсировать сопротивление последовательности примерно на 75%. Затем для измерения токов всей ячейки можно использовать ступенчатые измерения напряжения или протоколы линейного изменения. После диссоциации сетчатки можно идентифицировать первичные, вторичные и прекапиллярные артериолы на основе их калибра и расположения гладкомышечных клеток сосудов.

Артериолы первого и второго порядка визуально похожи при светлопольной микроскопии, но могут быть различимы на основании их размера. Прекапиллярные артериолы являются самыми мелкими артериальными сосудами в препарате и легко узнаваемы благодаря прерывистому расположению гладкомышечных клеток сосудов. Изолированные артериолы могут быть четко дифференцированы от капилляров и венул в пределах изоляции.

Капилляры проявляются в виде сети сосудов малого калибра диаметром от четырех до 10 микрометров, в то время как венулы тонкостенные и не имеют покрытия гладкими мышечными клетками. Первичные, вторичные и прекапиллярные артериолы подходят для миографии давлением, визуализации кальция и исследований с помощью пластыря. Используя артериолы под давлением, мы исследовали молекулярные механизмы, участвующие в генерации миогенного ответа.

Микрофотографии на этом изображении показывают артериолы сетчатки глаза крысы в различные моменты времени в ходе эксперимента по миографии давлением. На приведенном ниже графике временного хода показаны изменения диаметра сосуда в течение всего эксперимента. Сразу после нагнетания давления сосуд расширяется, за чем следует активное миогенное сужение, достигающее устойчивого уровня через 15 минут.

Добавление вортманнина в раствор Ганкса с нулевым содержанием кальция в конце эксперимента расширяет сосуд до его пассивного диаметра с целью нормализации. На этом слайде показан пример одноканальной записи патч-зажима из гладкомышечной клетки артериолы сетчатки до и после растяжения мембраны. Этот пластырь на клетке содержит два канала TRPV2, активируемых растяжением, активность которых увеличивается при приложении отрицательного давления к пипетке пластыря.

Описанные здесь протоколы требуют практики, но должны быть достижимы с минимальным устранением неполадок. Мы рекомендуем использовать выделенные артериолы в тот же день, что и изоляция. Метод оптимизирован для артериол сетчатки крыс, но может быть использован на сетчатке мышей.

Мы широко использовали этот препарат, но там, где это возможно, мы также пытаемся подтвердить наши ключевые результаты с помощью целых креплений сетчатки ex vivo и измерений диаметра кровеносных сосудов и кровотока in vivo.