Градиент температуры пробирного для определения тепловой предпочтения личинок дрозофилы

Этот метод может быть использован для решения ключевого вопроса в области соматоощущения — механизма, с помощью которого животное, такое как drosophila melanogaster, выбирает предпочтительную температуру окружающей среды. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет установить предпочтительную температуру группы личинок в одном анализе при столкновении с непрерывным диапазоном температур. В дополнение к получению информации о температурных предпочтениях личинок дрозофилы, импресс-пластина также может быть адаптирована для использования с другими модельными организмами, такими как червь C. elegans.

Сначала делаем дрожжевую пасту для приготовления флаконов для креста. Смешайте дрожжевые гранулы в дистиллированной воде и измельчите их в пасту с помощью пестика. Затем добавьте немного дрожжевой пасты рядом с внутренними стенками стандартных флаконов дрозофилы, прямо над поверхностью пищи.

Для производства личинок собирают от 12 до 35 самок и вдвое меньше самцов, но не более 10 самцов. Соедините эти группы в пузыре, содержащем дрожжевую пасту. Загрузите подготовленные флаконы в лоток на 100 флаконов.

Положите в лоток 20 открытых флаконов с водой, чтобы обеспечить влажность. Затем запечатайте лоток в прозрачный полиэтиленовый пакет и выдерживайте его при температуре 25 градусов Цельсия в течение 48 часов. После 48 часов кормления и спаривания пересадите мух в новые флаконы с пищей для сбора яиц.

Нажмите на них. Не используйте углекислый газ. Затем дайте мухам отложить яйца в течение трех часов при температуре 25 градусов по Цельсию.

Позже удалите взрослых особей и поместите флаконы с яйцами обратно в лоток с водяными флаконами и закройте пакет. Затем разовьйте яйца при температуре 25 градусов Цельсия до нужной личиночной стадии. Чтобы получить единый направленный градиент, сначала создайте окружающую среду для анализа.

Поместите два алюминиевых блока, соединенных в отдельные водяные бани, на влажные бумажные полотенца на расстоянии 10 сантиметров друг от друга. Водяные бани нужно заранее прогреть. Далее внесите 100 миллилитров 1%-ной агарозы и добавьте по 25 миллилитров в каждую пробирную пластину на ровной поверхности.

Как только агароза застынет, аккуратно потрите поверхность меламиновой губкой, чтобы поверхность стала слегка грубой. Затем, чтобы обеспечить эффективный перенос температуры, заполните все зазоры между алюминиевыми блоками в пробирных пластинах водой, подаваемой из пульверизатора. Теперь поместите пробные пластины на алюминиевые блоки и убедитесь, что границы находятся на расстоянии двух сантиметров от каждого края, чтобы точно совпадать с краями алюминиевых блоков.

Далее распылите пленку воды на поверхность пластин, чтобы гели не высохли. Далее накройте систему картонной коробкой, чтобы уменьшить испарение и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите от пяти до 10 минут, чтобы температура стабилизировалась.

Затем проверьте температуру поверхности пластины не менее чем в 12 местах, чтобы убедиться, что везде равномерная температура, плюс-минус два градуса Цельсия. Затем установите на место крышку коробки до тех пор, пока не будет проведен анализ. Чтобы выделить чистых личинок, сначала добавьте в пробирку 40 мл 18% раствора сахарозы около 50 миллилитров

Затем перенесите в раствор личинки из кучки корма, используя совку. Далее тщательно перемешайте личинки вокруг в растворе, используя совку. Теперь подождите от 30 до 60 секунд, пока личинки не доплывут до верхнего слоя трубки.

Затем слейте раствор с личинками в еще одну 50-миллилитровую пробирку и долейте свежую 18%-ную сахарозу. Снова дождитесь, когда личинки всплывут. Наличие пищи может повлиять на результаты.

Поэтому для получения воспроизводимых результатов важно проводить тщательную очистку личинок, чтобы свести к минимуму загрязнение продуктами питания. Делайте это аккуратно, во избежание повреждения личинок. Затем поместите сетчатый фильтр для клеток размером 300 микрон поверх 50-миллилитровой трубки, затем удалите все мертвые тела взрослых людей и плавающий мусор с поверхности раствора сахарозы.

Теперь вылейте личинок через ситечко, чтобы собрать их на сетчатом экране. Затем дважды пропустите через ситечко около 50 миллилитров воды, чтобы еще больше очистить личинки. Затем на пустую 35-миллиметровую посуду смойте большую часть личинок из ситечка, используя воду.

С помощью кисти перенесите оставшиеся личинки на сетку. Затем откачайте большую часть воды из чашки с помощью микропипетки. Затем накройте блюдо крышкой вверх дном, чтобы личинки не смогли убежать.

Теперь дайте личинкам восстановиться в течение 10-20 минут, прежде чем начинать анализ. Сначала снимите картонную коробку над гелем и быстро проверьте температуру поверхности геля. Если поверхность сухая, распылите на нее небольшое количество воды.

Если гель хороший, то загрузите от 100 до 200 личинок в центр каждой пластины, используя маленькую кисть. Затем накройте каждую пробирную пластину крышкой, чтобы поймать личинок, и накройте установку картонной коробкой, чтобы предотвратить попадание света. В настоящее время проводится анализ.

Через 10–30 минут снимите картонную коробку и крышку микропланшета. Затем сфотографируйте пластины сверху, чтобы зафиксировать положение личинок. Поместите коробку над камерой, чтобы избежать отражения на поверхности геля.

Чтобы навести порядок в тарелке, отсасывайте всех личинок туда, где они могли разлететься. Теперь рассчитайте процентное распределение личинок в каждой зоне с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Проведите линии через каждые два сантиметра, исходя из разграничений на пробирной пластине и подсчитайте количество личинок в каждой зоне.

При подсчете следует игнорировать личинок, распределенных в гребнях на расстоянии 0,5 сантиметра от каждого края, так как толщина геля и температурные условия вблизи края неравномерны. При температуре от 18 до 28 градусов Цельсия однонаправленный градиент был сделан с помощью водяных бань с температурой 16,8 градусов Цельсия и 31 градуса Цельсия. Распределение температуры по градиенту оказалось почти линейным.

Контрольные личинки были проанализированы в разном возрасте. Личинки первого, второго и начала третьего возраста показали пиковые предпочтения для зоны 24 градусов Цельсия. В середине третьего возраста большинство личинок скапливалось в зоне 18 градусов по Цельсию.

Неблуждающие личинки позднего третьего возраста были плотно сгруппированы в зоне 18 градусов Цельсия. Склонность к накоплению в зоне 18 градусов Цельсия в контрольной линии, которой был Уайт 1118, не была обусловлена краевым эффектом, поскольку личинки позднего третьего возраста все еще накапливались в зоне 18 градусов Цельсия, используя двунаправленный градиент. Когда мы проанализировали мутации личинок позднего третьего возраста, необходимые для различения температуры, результаты изменились.

Личинки с нулевой мутацией в trpA1 равномерно распределены по всему градиенту от 18 до 28 градусов Цельсия. Личинки, у которых отсутствовали только изоформы A и B или изоформы C и D trpA1, также показали серьезные нарушения. Личинки с мутацией в одном из двух генов, кодирующих фосфолипазу c бета, norpA, также были нарушены.

Однако личинки с мутацией в гене, кодирующем другую фосфолипазу c beta, plc21c, вели себя нормально. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как получить воспроизводимые результаты с помощью непрерывного термического градиента, который позволит сравнить температурные предпочтения личинок дикого типа и мутантных дрозофил. После освоения этой техники ее можно сделать за 30 минут за один анализ.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно обращать внимание на состояние флаконов с мухами и не использовать личинки, если они пересохли. Такая методика упрощает открытие новых генов, необходимых личинкам дрозофил для выбора излюбленной температуры в комфортном диапазоне.