Лактатдегидрогеназа Assay поглощение — Простой и надежный метод для определения активности сыпучих Autophagic поглощения в клетках млекопитающих

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аутофагии, например, как регулируется образование аутофагосом и как различные методы обработки клеток и условия влияют на объемную аутофогию. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она измеряет эндогенную секвестрацию груза. Таким образом, метод широко применим и не зависит от искусственной сверхэкспрессии или введения грузовых зондов.

Демонстрировать процедуру будут Паула Салаи и Мортен Лур, аспиранты из моей лаборатории. Для начала культивируйте адгезивные клетки в колбах для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров во увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Позвольте клеткам расти, пока они не достигнут почти сливающегося клеточного слоя.

После этого промойте клетки тремя миллилитрами PBS при температуре 37 градусов Цельсия при pH 7,4. Удалите PBS и замените его тремя миллилитрами 0,25% трипсина ЭДТА. Инкубируйте во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, пока клетки не отделятся.

Далее ресуспендируют клетки в семи миллилитрах питательной среды, содержащей 10% FBS, и переложили в стерильную 50-миллилитровую пробирку. С помощью наконечника для дозатора объемом от 0,5 до 20 микролитров переведите 10 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку, содержащую 10 микролитров трипанового синего. Используйте тот же наконечник для дозатора, чтобы немедленно заполнить предметное стекло счетной камеры и подсчитать ячейки в автоматическом счетчике клеток.

Затем используют питательную среду, содержащую 10% FBS, для приготовления подходящего разведения клеточной суспензии. Используя асептические методы, засейте один миллилитр разбавленной клеточной суспензии в каждую лунку 12-луночного планшета для культуры тканей. Инкубируйте во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток.

При желаемых экспериментальных обработках оставляют один набор скважин необработанным с целью определения фоновых уровней осадочных ЛДГ. За три-четыре часа до сбора урожая добавьте в каждую лунку насыщающее количество ингибитора постсеквестрации бафиломицина А1. Инкубируйте в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

В конце лечебного периода проводится отсасывание для аспирации среды. В каждую лунку добавьте по 200 микролитров разогретого до 37 градусов Цельсия раствора для отсоединения клеток. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока клетки не отделятся.

Добавьте в каждую лунку 500 микролитров PBS комнатной температуры при pH 7,4, содержащей 2% BSA. С помощью пипетки повторно суспендируйте каждую лунку до тех пор, пока не исчезнут сгустки клеток. После этого сразу же переложите клеточную суспензию в каждой лунке в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра на льду.

Центрифугируйте пробирки при 400 g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы осадить клетки. Используйте отсасывание для тщательной аспирации надосадочной жидкости, оставляя гранулы клеток как можно более сухими. Затем добавьте в каждую пробирку 400 микролитров раствора, содержащего 10% сахарозы в ультрачистой воде.

С помощью пипетки ресуспендируйте клеточную гранулу для получения суспензии, близкой к одноклеточной. Перенесите эту суспензию на четырехмиллиметровую электропорационную кювету. Поместите кювету в электропоратор с экспоненциальной волной затухания и разрядите один электрический импульс при напряжении 800 вольт, 25 микрофарадах и 400 Ом.

С помощью нового наконечника для пипетки перенесите разрушение клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 400 микролитров ледяного раствора сахарозы с буферизацией из ледяного фосфата, и кратковременно перемешайте с помощью пипетирования. Повторите этот процесс ресуспендирования, электроразрушения и смешивания для каждого образца. Если вы выполняете процедуру впервые, обязательно проверьте эффективное и селективное электроразрушение плазматической мембраны, как описано в тексте.

Чтобы получить осажденные фракции ЛДГ, удалите 550 микролитров из каждого разбавленного раствора для разрушения клеток и перенесите его в отдельную двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку, содержащую 900 микролитров ледяного ресуспензионного буфера с 0,5% BSA и 0,01% Tween 20. Пипеткой коротко перемешать. Центрифугируйте при 18 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 45 минут для получения гранул, содержащих осадок LDH.

С помощью всасывания тщательно отсасывайте надосадочную жидкость, чтобы гранулы оставались как можно более сухими. Храните осажденные образцы LDH при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к анализу. Для общего количества фракций ЛДГ переведите по 150 микролитров из каждой из разбавленных клеток растворов для разрушения в отдельную новую пробирку.

Храните их в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к анализу. Разморозьте как осадившиеся образцы ЛДГ, так и общие образцы ЛДГ на льду. После размораживания добавьте 300 микролитров ледяного ресуспензионного буфера, содержащего 1,5% Triton X-405, к общему количеству образцов LDH.

Поверните образцы на валике в холодном помещении в течение 30 минут. Затем добавьте 750 микролитров ледяного ресуспензионного буфера, содержащего 1% Triton X-405, в осажденные образцы LDH. Используйте пипетку для ресуспендирования гранул до тех пор, пока раствор не станет однородным.

Центрифугируйте все образцы при температуре 18 000 g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы осадить нерастворенный клеточный мусор. После завершения центрифугирования поместите образцы на лед. Определите уровни ЛДГ в надосадочной жидкости, используя либо классический ферментативный анализ, как описано в тексте, либо любой из широкого разнообразия коммерчески доступных наборов.

В этом исследовании активность объемной аутофагической секвестрации контролируется в ряде различных клеточных линий млекопитающих. Как показано на рисунке, как базальная, так и индуцированная голоданием секвестрация ЛДГ и клетки LNCaP полностью отменяются ингибитором пан-PI3-киназы 3MA. Селективный ингибитор PI3-киназы третьего класса, SAR-405 и ингибитор кальциевого насоса ER, тапсигаргин.

В клетках HEK293 секвестрация ЛДГ в условиях голодания сильно снижается как тапсигаргином, так и ингибитором ULK, MRT 67307. Кроме того, показано, что секвестрация ЛДГ, вызванная голоданием, последовательно ингибируется 3MA в других наблюдаемых клеточных линиях. Затем используются различные MEF с нокаутом гена ATG, чтобы проверить, требуются ли гены, связанные с аутофагией, которые, как сообщается, важны для формирования аутофагосом, для секвестрации ЛДГ.

Как видно, секвестрация ЛДГ, вызванная голоданием, отменена в нокаутных MEFS ATG5. Более того, он также притупляется в нокаутирующих MEF ATG7 и ATG9A. Наконец, определены эффекты РНК-интерференцированного сайленсинга ключевых транскриптов гена ATG.

Трансфекция с нацеливанием на миРНК ATG9A или с комбинированным нацеливанием на ULK1 и ULK2 значительно снижает секвестрацию LDH в клетках LNCaP. При выполнении этой процедуры важно быть точным на всех этапах пипетирования. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ деградации долгоживущих белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, наблюдались ли изменения в активности секвестрации, приводящие к сопоставимым изменениям активности аутофагической деградации.

После внедрения этого метода в клеточные линии млекопитающих мы использовали его, чтобы продемонстрировать, что объемная аутофагия не зависит от семейства белков LC3 и вместо этого требует GABARAP. Это подчеркивает важность использования LC3-независимых методов для мониторинга активности аутофагии.