На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейродегенеративных заболеваний, например, какие генетические факторы и пути регулируют токсичность белков, связанных с заболеванием. Основное преимущество этого метода заключается в том, что высокоэффективный процесс спаривания дрожжей используется для скрининга моделей дрожжей на основе большой коллекции библиотечных генов. Хотя этот метод может дать представление о токсичности белков нейродегенеративных заболеваний, он также может быть применен для изучения других клеточных процессов в дрожжах, таких как толерантность к другим стрессовым состояниям.

Начните эту процедуру с выделения пяти микролитров плазмидной ДНК на лунку плазмидной матрицы на 96-луночные планшеты с круглым дном. Держите тарелки при температуре четыре градуса Цельсия. Далее инокулируйте 150 миллилитров пептона дрожжей декстрозы или среды YPD в колбу объемом 500 миллилитров с колонией гаплоидного штамма дрожжей W303 Alpha.

Инкубируйте культуру при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин в течение ночи. На следующее утро, после измерения OD600 ночной культуры, разбавьте культуру до OD600 0,1 в двух литрах YPD. Инкубировать при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин в течение примерно пяти часов, пока культура не достигнет OD600 от 0,4 до 0,6.

Чтобы собрать дрожжевую культуру, наполните восемь стерильных 250-миллилитровых бутылок центрифуги и центрифугируйте при температуре 3000 xG в течение 10 минут при комнатной температуре. Слейте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Промойте дрожжи, как описано в текстовом протоколе, и объедините клетки в две центрифужные пробирки.

Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 25 миллилитрах 0,1 молярного раствора ацетата лития. Объедините ресуспендированные клетки, добавьте пять миллилитров ДНК спермы лосося и переложите их в колбу объемом 150 миллилитров. Инкубировать при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 225 об/мин в течение 30 минут.

Через 30 минут перелейте клеточную смесь в стерильный одноразовый резервуар для реагента. С помощью многоканальной пипетки перенесите по 35 микролитров клеточной смеси в каждую лунку круглого дна 96-луночных планшетов, содержащих библиотеку плазмидной ДНК, приготовленной ранее. Переведите 96-луночные планшеты со скоростью 1000 об/мин в течение одной минуты.

Выдерживайте пластины при температуре 30 градусов Цельсия без встряхивания в течение 30 минут. Не складывайте пластины друг на друга, так тепло может передаваться более эффективно. Извлеките 96-луночные планшеты из инкубатора с температурой 30 градусов Цельсия и перемешайте их при 1000 об/мин в течение 30 секунд.

Добавьте 125 микролитров буфера для трансформации в каждую лунку, а затем переведите пластины на 1000 об/мин в течение одной минуты. Инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем подвергнуть дрожжей тепловому шоку, поместив пластины в инкубатор с температурой 42 градуса Цельсия на 15 минут.

Центрифугируйте планшеты при 3000 xG в течение пяти минут. Удалите буфер преобразования из лунок, перевернув пластины над мусорным баком и с силой сбросив буфер из пластин. Быстро промокните перевернутые пластины на чистом бумажном полотенце, чтобы удалить жидкость с тарелок.

Промойте клетки, добавив в каждую лунку по 200 микролитров минимальной выпадающей среды, соответствующей выбираемому маркеру на библиотечной плазмиде. Здесь используется синтетическая среда ура минус. Центрифугируйте планшеты при 3000 xG в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость над мусорным ведром, как показано ранее. Добавьте в каждую лунку 160 микролитров минимальной уры минус среды, содержащей 2% глюкозы, и перебейте пластины при 1000 об/мин в течение одной минуты. Инкубируйте планшеты без встряхивания при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Через 48 часов на дне каждой лунки должна быть видна гранула трансформированных дрожжей. С помощью дозатора жидкости добавьте по 100 микролитров уры минус среды, содержащей глюкозу, в каждую лунку нового набора 96-луночных планшетов. Переведите в вихревой пузырь пластины, содержащие преобразованные дрожжи, при 1000 об/мин в течение 30 секунд.

С помощью стерильного пластикового 96-контактного репликатора поместите штифты в лунки, содержащие трансформированные дрожжи, а затем вживите их в соответствующие лунки новых пластин, заполненных средой. Инкубируйте новые планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов. Через 24 часа на дне каждой лунки должна быть видна дрожжевая гранула, содержащая успешно трансформированные дрожжи.

Чтобы сохранить эти штаммы дрожжей в качестве запасов глицерина, добавьте 50 микролитров 50% глицерина в каждую лунку, сдавите пластины при 1000 оборотах в минуту в течение 30 секунд, запечатайте пластины алюминиевой фольгой и заморозьте при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы оживить библиотечные штаммы из запасов глицерина, достаньте 96-луночные планшеты из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов по Цельсию, снимите алюминиевую фольгу и дайте дрожжам оттаять при комнатной температуре в течение примерно 30 минут. После того, как дрожжи оттают, используйте стерильный пластиковый 96-контактный репликатор для инокуляции запасов глицерина в 160 микролитров свежей уры за вычетом среды, содержащей 2% глюкозы, в 96-луночных планшетах и инкубируйте при 30 градусах Цельсия в течение 24 часов.

Сразу после того, как библиотечные штаммы будут использованы, запечатайте пластины, и верните их в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию. В тот же день, когда библиотечные штаммы размораживаются, инокулируйте штамм дрожжей запроса в 50 миллилитров YPD и выращивайте при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 250 оборотах в минуту в течение ночи. На следующее утро насыпьте штамм дрожжей в стерильный одноразовый резервуар для реагентов и добавьте 160 микролитров дрожжей в каждую лунку 96-луночного планшета.

С помощью дозатора жидкости диспенсируйте 160 микролитров на лунку среды YPD в 96-луночные планшеты. Кратковременно нанесите вихревую обработку 96-луночных планшетов, содержащих запрашиваемый штамм, и библиотечные тензивные планшеты, а затем используйте стерильный 96-контактный репликатор для переноса библиотечных штаммов на планшеты YPD, которые были модифицированы запрашиваемым штаммом. Инкубируйте планшеты YPD при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов.

Через 24 часа на дне каждой лунки будет видна гранула дрожжей. Заполните 96-луночные планшеты минимальной отслаивающейся средой, содержащей 2%-ную рафинозу, соответствующую выбираемым маркерам на плазмиде в запрашиваемом штамме, а также на библиотечной плазмиде. Используйте стерильный 96-контактный репликатор для переноса дрожжей из спаривающихся культур YPD в селективную среду.

Инкубируйте 96-луночные планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов. Только дрожжевые клетки, которые спаривались и образовывали диплоидные клетки и, следовательно, содержат как запрашиваемую плазмиду, так и библиотечную плазмиду, смогут расти в этой среде. После 48 часов роста в селективной среде, содержащей рафинозу, обратите внимание, что на дне лунок, содержащих диплоидные клетки, видна гранула.

Переведите 96-луночные планшеты со скоростью 1000 об/мин в течение одной минуты. Используйте роботизированную вычислительную машину, чтобы обнаружить дрожжи на агаровых пластинах в четырехугольных пластинах, содержащих 2% галактозы и 2% агара, и в тарелках, содержащих 2% глюкозы и 2% агара. После пятнистости дайте агаровым пластинам высохнуть, а затем поместите их вверх дном в инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия на четыре дня.

Каждые 24 часа фотографируйте агаровые пластины, чтобы зафиксировать рост дрожжей. Токсичность ассоциированного с БАС белка FUS была впервые изучена на диплоидных дрожжах. Как указывает агаровая пластина, содержащая галактозу, которая индуцирует ФУЗ, токсичность ФУС одинакова как у диплодов, так и у гаплоидных дрожжей.

Пять генов, ранее идентифицированных как супрессоры токсичности FUS с помощью метода, основанного на трансформации, были протестированы методом скрещивания. Первая полоса представляет собой контрольный штамм дрожжей, преобразованный с помощью двух пустых векторов. Вторая полоса — это диплоидный штамм дрожжей FUS с пустым вектором, в котором экспрессия FUS очень токсична.

Дорожки с третьей по седьмую показывают диплоидные дрожжи, экспрессирующие FUS, а также ген подавления. Все пять генов устраняют токсичность ФУС в диплоидных дрожжах, что указывает на эффективность метода спаривания. Этот метод, основанный на скрещивании, был затем применен к скринингу библиотеки сверхэкспрессии 940 генов.

И показана фотография одной представительской тарелки. Как указано на пластине с галактозой, где экспрессируются FUS и библиотечные гены, FUS был токсичен для дрожжевой клетки diplod. Библиотечный ген, обозначенный зеленым квадратом, спас от токсичности ФУЗ.

В то время как библиотечный ген, обозначенный красным квадратом, усиливает токсичность. После освоения этой техники ее можно сделать за 120 часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно заранее убедиться, что фенотип, используемый для скрининга, не зависит от типа гаплоидного спаривания.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как идентифицировать генетические факторы при гиперэкспрессии, которые спасают токсичность белков, связанных с болезнями, в дрожжах. После его разработки этот метод может проложить путь исследователям в области нейродегенеративных заболеваний к изучению механизмов цитотоксичности белков, связанных с заболеванием, в модели дрожжей. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ бета-галактозидазы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, является ли спасение специфичным.