Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в любой области исследований, где сигнал фосфорилирования представляет интерес, например, в области рака, для оценки изменений в сигнальных сетях после терапевтической резистентности. Основное преимущество этого метода заключается в том, что тысячи фосфопептидов могут быть идентифицированы относительно простым и недорогим способом для глобальной оценки фосфопротеома. Чтобы собрать опухолевую ткань, взвесьте опухоль и в культуральную пробирку добавьте два миллилитра ледяного буфера для лизиса на каждые 100 миллиграммов ткани.

Затем используйте ручной или настольный гомогенизатор для гомогенизации лизата. Чтобы уменьшить и заспиртовать образец, нагрейте пробирку до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, затем охладите образец на льду в течение 15 минут. Еще находясь на льду, трижды обработайте лизат ультразвуком, затем нагрейте образец до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Поместите ультразвуковую трубку в качающийся ротор ведра и центрифугируйте лизат при 3 500 г и 15 градусах Цельсия в течение 15 минут, затем соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу. Чтобы переварить лизат, используйте 100 миллимолярный трис, чтобы разбавить образец в 12 раз, чтобы уменьшить количество гуанидиния. Для получения пяти миллиграммов белка добавьте 10 микрограммов лизилэндопептидазы или лиз-С и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение пяти-шести часов.

Приготовьте один миллиграмм на миллилитр обработанного TPCK трипсина в одном миллимолярном гидрохлориде с добавлением 20 миллимолярных хлоридов кальция и трипсина в соотношении один к 100 трипсину к белку. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем добавьте в пробирку дополнительную аликвоту трипсина и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Добавьте образец в 15 миллилитровый фильтр с отсечкой 10 килодальтон. Центрифугируйте образец в качающемся ведре или роторе с фиксированным углом наклона при температуре 3,500 г и 15 градусов Цельсия до тех пор, пока объем ретентата не станет менее 250 микролитров. Затем соберите проточный поток и выбросьте ретентат.

Чтобы подкислить образец, добавьте примерно 20 микролитров 5% трифторуксусной кислоты или ТФК на миллилитр лизата. Хорошо перемешайте пробирку и используйте полоску pH для измерения pH. При необходимости добавьте еще 5% TFA, чтобы довести pH до 2,5.

Затем подсоедините более короткий конец колонки C18 к вакуумному коллектору. После установки вакуума в диапазоне от 17 до 34 кПа используйте три миллилитра 100% ацетонитрила и стеклянную пипетку для увлажнения колонки. Уравновесьте колонку с помощью стеклянной пипетки и внесите две трехмиллилитровые аликвоты 0,1% TFA.

Затем загрузите подкисленный образец в колонку. Используйте три трехмиллилитровых объема 0,1 TFA для промывки колонки. Затем нанесите два миллилитра 40% ACN 0,1% TFA для элюирования образца и соберите две двухмиллилитровые фракции в стеклянные пробирки для культуры.

С помощью парапленки накройте элюентные трубки и с помощью иглы 20 калибра проделайте от трех до пяти отверстий в крышке, прежде чем лиофилизировать образцы на ночь. Ресуспендируйте лиофилизированный порошок с помощью 0,5 миллилитров ледяного иммунопреципитации или буфера, связывающего IP, в каждой фракции. Перенесите 0,5 миллилитра объема ресуспензии из второй фракции в пробирку с первой фракцией и сохраните наконечник пипетки.

Используйте еще 0,5 миллилитра IP-буфера для промывки каждой пробирки лиофилизации перед переносом содержимого в криопробирку, затем повторите промывку, используя два миллилитра IP-буфера. После использования P200 с разрезанным наконечником для переноса 0,5 мг на миллилитр суспензии гранул антител в микропробирку добавьте 450 микролитров ледяного буфера для связывания IP, чтобы промыть 50 микролитров суспензии из гранул антител 4G10 и 25 микролитров суспензии из гранул антител 27 B10.4 в микрофуге. Центрифугируйте пробирку при 100 г и четырех градусах Цельсия в течение одной минуты.

После аспирации надосадочной жидкости добавьте равный объем в качестве исходной суспензии буфера для связывания IP для ресуспендирования шариков. Добавьте предварительно промытые шарики pY в ресуспендированный раствор образца в криопробирках с завинчивающейся крышкой, затем инкубируйте их при температуре четыре градуса Цельсия на торцевом вращателе в течение ночи. После прядения бусин сохраните надосадочную жидкость, которая будет использоваться для обогащения пептидами pST.

Затем используйте 300 микролитров буфера для связывания IP для ресуспендирования шариков и перенесите их в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Уменьшите количество образцов при 100 г и четырех градусах Цельсия в течение одной минуты. Затем с 500 микролитрами буфера для связывания IP промойте бусины три раза.

Четыре раза промойте шарики 450 микролитрами 25 миллимолярного бикарбоната аммония pH 7,5. Опустите гелевый насадочный наконечник немного ниже поверхности шарика и полностью отасуньте надосадочную жидкость. Добавьте к бусинам в четыре раза больший объем 0,1% TFA.

Затем хорошо перемешайте их и инкубируйте пробирку в термомиксере при 1 000 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Перенесите ресуспензию в спиновой фильтр с плотностью 0,2 микрометра и центрифугируйте фильтр при плотности 850 г в течение одной минуты. После переноса элюирования в микроцентрифужную пробирку с низким содержанием белка вакуумную концентрацию элюента до сухости при температуре 40 градусов Цельсия с временем нагрева 300 минут в течение ночи.

Для приготовления шариков оксида титана, содержащихся в типсах, добавьте 200 микролитров 100% ACN. Затем переверните его и переверните узким концом, чтобы переместить жидкость к крышке. С помощью лезвия бритвы отрежьте кончик и поместите его на трубку с низким содержанием белка.

Затем снимите колпачок и вставьте микропипетку, чтобы выгрузить остатки ACN, прежде чем повторить промывку. Предварительно подготовьте диоксид титана с 500 микролитрами 100% ACN два раза. Затем дважды смешайте диоксид титана с 500 микролитрами 0,2 молярного буфера фосфата натрия с pH 7.

Наконец, используйте 300 микролитров уравновешивающего буфера, чтобы промыть бусины три раза. Добавьте 400 микролитров 50% ACN 0,1% TFA в пробирку с низким содержанием белка. Затем добавьте 84 микролитра молочной кислоты.

Перенесите ресуспендированные фосфопептиды в трубку с низким содержанием белка и инкубируйте их при комнатной температуре с помощью вращателя «конец за концом» в течение одного часа. После гранулирования шариков используйте 300 микролитров уравновешивающего буфера, чтобы промыть их два раза и открутить. С 300 микролитрами буфера для полоскания промойте шарики два раза.

Затем переложите их в светофильтр с давлением 0,2 микрометра. После отжима перенесите фильтрующий блок в чистую 1,5-миллилитровую пробирку с низким содержанием белка и с 200 микролитрами 0,9% аммония в воде дважды разбавьте содержимое. После проверки рН вакуумируйте концентрат элюента до сухости на ночь, чтобы выпарить аммиак.

Чтобы обессолить пептиды для анализа на МС, восстановите фосфопептиды с помощью 15 микролитров 0,1% TFA. Очистите образец с помощью наконечника C18 с связывающей способностью пять микрограммов и следуйте протоколу производителя. Наконец, после полного высыхания объема элюирования с помощью вакуумной концентрации, суспендировать высушенные фосфопептиды в 12,5 микролитрах раствора масс-спектрометрии.

Этот окрашенный в Кумасси гель предварительно переваренного лизата подтверждает наличие белков, в то время как окрашивание переваренного лизата подтверждает полное переваривание. Для полного разложения не должно быть полос выше 15 килодальтон, за исключением полос 30 килодальтон и 23,3 килодальтон для lys-C и трипсина соответственно. Добавление lys-C также уменьшает количество пропущенных спайвений.

Иммунопреципитация pY эффективно отделяет pY от пептидов pST: в среднем 85% фосфопептидов, идентифицированных из препарата pY, являются pY, и более 99% фосфопептидов, идентифицированных из препарата pST, являются pST. Диоксид титана используется для обогащения фосфопептидами в обоих препаратах. Ожидаемый процент фосфорилированных пептидов в готовом препарате МС составляет от 30 до 50%, и большинство обнаруженных фосфопептидов имеют одинарную или двойную фосфорильную группу.

После выполнения масс-спектрометрии необработанные файлы MS загружаются в программное обеспечение для анализа MS. Как показано здесь, установка порогового значения вероятности локализации более 0,75 отфильтровывает приблизительно 5% пептидов pY и 15% и 34% пептидов pS и pT соответственно. После применения этих фильтров ожидаемое количество идентификаций фосфофопептидов в конце анализа МС составляет приблизительно 300 пY пептидов для пяти миллиграммов исходного белка и около 7500 pS пептидов и 640 pS пептидов для 2,5 миллиграммов начального количества пептидов из соответствующих обогащенных препаратов.

После освоения эта техника может быть выполнена за шесть дней, если этапы pY и pST выполняются параллельно. Однако для более чем восьми образцов выполняйте эти шаги последовательно, чтобы уменьшить техническую ошибку в течение дополнительных четырех дней. Выполняя эти процедуры, важно помнить о том, что нужно сосредоточиться на деталях.

Каждый шаг важен и может повлиять на качество окончательной подготовки, в том числе критически важен необходимый контроль качества. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как извлекать и переваривать белки с последующим обогащением фосфопептидом для анализа с помощью масс-спектрометрии для исследования глобальных изменений в фосфопротеоме.