Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

Этот метод может помочь при проведении диагностики на месте оказания медицинской помощи, пациентам с признаками вирусных инфекций. Основное преимущество данной методики заключается в том, что ее можно проводить без лабораторного оборудования и электричества, а значит, проводить в больничной палате. Демонстрировать процедуру забора крови будут доктор медицины Андерс Фомсгаард и ученый Мортен Расмуссен, оба из моей лаборатории.

Начните с подготовки пробирок для сбора крови. Используйте иглу 25 калибра в один дюйм, прикрепленную к шприцу объемом 3 мл, чтобы ввести 1,6 мл коммерческого буфера для лизиса в вакуумную пробирку ЭДТА объемом 4 мл. Крайне важно поддерживать вакуум в пробирке для сбора крови для сбора крови.

Следовательно, всегда используйте иглу для введения лизисного буфера в пробирку для сбора крови. Затем полностью повторно суспендируйте 960 микролитров магнитных стеклянных частиц или MGP и переложите их в пробирку объемом 1,8 мл с маркировкой. Затем пипетку 4 мл промывочного буфера 1 в пробирку 4,5 мл с маркировкой WB-1,1,5 мл промывочного буфера две в пробирку 3,6 мл с маркировкой WB-2 и 3 мл промывочного буфера 3 в пробирку 4,5 мл с маркировкой WB-3.

Наконец, добавьте 100 микролитров элюирующего буфера в тюбик объемом 1,8 мл с маркировкой EB и оставьте пробирки при комнатной температуре до использования. Для забора цельной крови пациента внутривенно используйте иглу-бабочку с удлинительной трубкой малого диаметра и одну из заранее подготовленных вакуумных пробирок для сбора крови, содержащую буфер для лизиса. Положите руку пациента в положение вниз.

Вставьте иглу-бабочку в вену пациента и прикрепите вакуумную трубку для сбора крови к удлинителю малого канала ствола. После сбора крови перемешайте содержимое пробирки, перевернув пробирку пять-десять раз. Продезинфицируйте внешнюю сторону пробирки с помощью 70% этанола.

Затем инкубируйте пробирки в течение 20 минут при комнатной температуре для инактивации вируса. Чтобы очистить нуклеиновые кислоты из собранной крови, снова перемешайте содержимое пробирки, перевернув вакуумную пробирку вручную пять-десять раз. Вылейте подготовленную аликвоту MGP непосредственно в пробирку для сбора крови.

Наденьте новую крышку от неиспользованной пробирки для сбора крови на пробирку с образцом. Положите палец на крышку, чтобы убедиться, что тюбик плотно закрыт, и перемешайте содержимое тюбика, перевернув пять-десять раз. Поместите трубку в магнитный держатель и держите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыта.

Затем несколько раз переверните магнитный держатель с трубкой, чтобы рассеять MGP, прежде чем они соберутся на стороне трубки с магнитом. Снимите крышку пробирки и слейте содержимое пробирки в пробирку объемом 50 мл с помощью одноразовой пипетки. Вылейте подготовленную аликвоту WB-1 непосредственно в пробирку для сбора крови и закройте пробирку крышкой.

Перемешайте содержимое вручную пять-десять раз. Затем соберите бусины сбоку от трубки с помощью магнита и удалите жидкость, как и раньше. Вновь суспензируйте бусины в подготовленной аликвоте ВБ-2, затем выбросьте раствор, и повторите процедуру с подготовленной аликвотой ВБ-3.

Наконец, извлеките пробирку из магнитного держателя и вылейте подготовленную аликвоту БЭ непосредственно в пробирку для сбора крови. Закройте трубку крышкой и снова подвесьте MGP, постучав пальцем пять-десять раз. Наконец, используйте одноразовую пипетку объемом 1,5 мл для переноса одной капли повторно суспендированных MGP в последующую реакционную смесь амплификации нуклеиновых кислот.

Обязательно полностью приостановите MGP перед тем, как перенести только одну каплю в реакцию ПЦР. Чтобы продемонстрировать доказательство концепции, отрицательные результаты анализа цельной крови были добавлены в 10-кратное количество разведений стандарта вируса Эбола, полученного во время недавней вспышки на юге Гвинеи, или три различные концентрации вируса Эпштейна-Барр. Экстрагированные нуклеиновые кислоты анализировали с помощью собственной вирус-специфической R2 кПЦР или кПЦР.

Чем ниже порог пересечения, или КТ, тем выше число копий вирусного генома. Здесь цельная кровь с различными концентрациями вируса Эбола была обнаружена с помощью специальной лампы, связанной с вирусом Эбола. Конечная концентрация вируса в образце цельной крови с шипами видна по оси X, а минуты до положительного результата — по оси Y.

В данном случае в цельную кровь добавляли 10-кратные разведения стандартизированного ВОЗ образца сыворотки для гепатита С с помощью специфичной для ВГС количественной ПЦР. Наконец, на этом изображении показаны результаты реакции, специфичной для вируса Эпштейна-Барр, на цельной крови, положительной на вирус Эпштейна-Барр. При попытке выполнить эту процедуру важно использовать указанный буфер связывания лизиса.

Это важный шаг и важнейший реагент для метода. Этот буфер, связывающий лизис, инактивирует вирус в образце. Следуя этой методике, вы можете выполнять различные методы молекулярного обнаружения, такие как лампа и ПЦР, и, следовательно, вы можете проводить дифференциальную диагностику.