Шприц инъекционные сетки электроники для стабильной хронической грызунов электрофизиологии

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронауки, например, как проявляются процессы старения в мозге, как развивается мозг, как возникают и прогрессируют заболевания мозга. Основное преимущество этого метода заключается в том, что сетчатая электроника не вызывает хронического иммунного ответа при глиозе после имплантации в мозг и обеспечивает бесшовную интеграцию с окружающей нервной тканью. Демонстрировать процедуру будут Тао Чжоу, аспирант Группы Либера, и Юнг Мин Ли, постдок в Группе Либера.

Чтобы начать процедуру, загрузите чистую кремниевую пластину в термический испаритель и испарите 100 нанометров никеля. Затем нанесите слой негативного фоторезиста СУ-8 2000.5 на пластину со скоростью 400 оборотов в минуту для получения приблизительной толщины СУ-8 от 400 до 500 нанометров. Загрузите пластину в выравниватель маски для экспонирования SU-8 с фотолитографической маской, которая соответствует нижнему слою сетки SU-8.

Экспонировать на I-линии в дозе 100 млджоулей на квадратный сантиметр. В них погрузите в лоток проявителя СУ-8. Аккуратно перемешивайте раствор в течение двух минут, пока сетчатый рисунок в СУ-8 не будет полностью разработан

Затем промойте в лотке с изопропиловым спиртом в течение одной минуты и высушите феном. Выпекайте на горячей плите при температуре 180 градусов Цельсия в течение часа. После этого нанесите слой LOR 3A на пластину со скоростью 4000 оборотов в минуту для получения толщины около 300 нанометров.

Прядильное покрытие S1805 с положительным фоторезистом при 4 000 оборотах в минуту при толщине примерно 500 нанометров. Затем загрузите пластину в юстировщик маски для экспонирования S1805 с помощью фотолитографической маски двух соответствующих металлическим межсоединениям и входной, выходной площадок. Экспонируется по H-линии в дозе 40 миллиджоулей на квадратный сантиметр, после чего погружают пластину в лоток с проявителем фоторезиста CD-26.

Осторожно помешивайте раствор в течение одной минуты, пока металлическая схема межсоединений не будет полностью разработана. Промойте в противне с деионизированной водой в течение одной минуты и высушите феном. Затем термически испаряются три нанометра хрома, а затем 80 нанометров золота.

Погрузите пластину в плоский стакан для снятия жидкости PG примерно на три часа, пока металл полностью не подрежется, оставив металл только в нужном межсоединении и на входе, выводе контактной площадки областей сетчатой электроники. Повторите нанесение спинового покрытия, литографию, испарение и снятие, чтобы оставить три нанометра хрома и 50 нанометров платины в области электродов. Затем повторите нанесение спиннингового покрытия и фотолитографию SU-8 для определения верхнего слоя сетки SU-8.

Обработайте пластину кислородной плазмой мощностью 50 Вт в течение одной минуты. После этого погрузите пластину в никель, травящий в растворе, примерно на три часа, пока сетчатая электроника полностью не освободится от кремниевой пластины. С помощью пастеровской пипетки перенесите высвободившиеся из сетки электронные щупы от травления никеля в стакан объемом 100 миллилитров с деионизированной водой.

Затем перенесите сетчатую электронику в свежий стакан с деионизированной водой не менее трех раз, чтобы обеспечить промывку. Чтобы загрузить сетчатую электронику в иглу, вставьте стеклянную капиллярную иглу в 100-миллилитровый стакан PBS, в котором находится сетчатая электроника. Расположите конец иглы рядом с входными, выходными прокладками сетчатого электронного щупа и вручную втяните шприц, чтобы втянуть сетчатый электронный щуп в иглу.

Нажмите и потяните поршень шприца, пока он все еще погружен в физиологический раствор, чтобы отрегулировать положение сетчатой электроники внутри иглы. Чтобы ввести сетчатую электронику в мозг мыши, используйте стоматологическую бормашину и стереотаксическую рамку, чтобы открыть трепанацию черепа в нужных координатах на черепе. Откройте вторую трепанацию черепа вдали от места инъекции для введения графического винта или проволоки из нержавеющей стали.

Затем закрепите прижимную подложку к черепу с помощью стоматологического цемента. Разрез в подложке шириной около одного миллиметра повышает надежность этапа складывания на более поздних этапах процедуры. После этого установите держатель пипетки с иглой, содержащей сетчатую электронику, в стереотаксическую рамку с помощью углового концевого зажима.

Прикрепите боковое отверстие держателя для пипетки к пятимиллилитровому шприцу, закрепленному в шприцевом насосе с капиллярной трубкой длиной от 0,5 до одного метра. Затем используйте стереотаксическую рамку, чтобы расположить кончик иглы в желаемом начальном месте в мозге. Расположите камеру так, чтобы верхняя часть сетчатого электронного щупа отображалась внутри стеклянной иглы.

Запустите поток, установив шприцевой насос на низкую скорость и нажав кнопку «Старт». Медленно увеличивайте скорость потока, если сетчатый электронный щуп не перемещается внутри иглы. Когда датчик сетчатой электроники начнет двигаться внутри иглы, используйте стереотаксическую рамку для втягивания иглы с той же скоростью, с которой вводится датчик сетчатой электроники, используя отмеченное исходное положение электроники сетки в качестве ориентира.

Продолжайте вводить физиологический раствор и втягивать иглу до тех пор, пока игла не выйдет из черепа. Затем остановите поток из шприцевого насоса. В этой процедуре используйте стереотаксическую рамку, чтобы осторожно направить иглу к плоской гибкой подложке, зажимающей кабель через зазор, пропуская раствор с помощью шприцевого насоса для создания слабины в межсоединениях сетчатой электроники.

Как только игла окажется над зажимной подложкой и через зазор, возобновите поток с высокой скоростью, чтобы ввести входные и выходные прокладки сетчатой электроники на зажимную подложку. С помощью пинцета и пипетки с деионизированной водой согните входную, выходную прокладки под углом 90 градусов как можно ближе к первой входной, выходной прокладке. После того, как входные, выходные площадки будут выровнены и сложены и под углом 90 градусов к стеблю сетки, высушите их на месте с помощью мягко протекающего сжатого воздуха.

Разрежьте прижимную подложку по прямому краю примерно в 0,5-1 миллиметрах от края входной, выходной прокладок. Также отрежьте посторонние части зажимной подложки, которые будут препятствовать вставке в монтируемую на печатную плату 32-канальный разъем zif. Затем вставьте входные, выходные контактные площадки в разъем zif на печатной плате и закройте защелку.

Используйте измерительную электронику для измерения импеданса между каналами и винтом заземления, чтобы подтвердить успешное сопряжение. Если значения импеданса слишком высоки, отсоедините разъем zif, отрегулируйте вставку и повторите проверку до тех пор, пока не будет подтверждено успешное подключение. Затем закройте разъем zif и открытые сетчатые электронные соединения стоматологическим цементом для защиты.

Переверните печатную плату в зазоре в подложке и закрепите печатную плату цементом на черепе мыши. Для свободного перемещения записей освободите мышь от ограничителя после установки печатной платы предусилителя и заземления эталонного винта. Записывайте данные в течение желаемого периода времени с помощью системы сбора данных, в то время как мышь ведет себя свободно.

Здесь представлены репрезентативные тепловые карты локального поля, полученные с помощью 32-канальных ячеистых электронных зондов, введенных в гиппокамп мыши и соматосенсорную кору. Данные были записаны, когда мышь свободно исследовала свою клетку через два месяца и четыре месяца после инъекции. Амплитуда потенциала локального поля имеет цветовую кодировку в соответствии с цветовой полосой справа.

Трассы фильтра высоких частот, черные, показывающие пиковую активность, наложены на спектрограмму для каждого из 32 каналов. Вот всплеск, выделенный после сортировки данных на графике. Одиночная спайковая активность была обнаружена на 26 из 32 каналов, как через два месяца после инъекции, так и через четыре месяца после инъекции.

При попытке выполнить эту процедуру важно не забыть проверить интерфейс ввода-вывода, чтобы убедиться в успешном электрическом подключении к сетчатому электронному щупу. Измерительное сопротивление помогает устранять неполадки в источнике любых проблем и имеет решающее значение для выявления проблем с интерфейсом или изготовлением. После этой процедуры может быть проведена гистология с целью изучения клеточной среды вокруг каждого зарегистрированного электрода.

В отличие от обычных, жестких зондов головного мозга, сетчатая электроника может быть оставлена в ткани во время гистологии, что позволяет точно соотнести данные электрофизиологии с иммуногистохимическим анализом.