Benchtop иммобилизованных металла аффинной хроматографии, воссоздание и меткой, Assay Polyhistidine Metalloenzyme для студентов лаборатории

Этот метод позволяет студентам бакалавриата быстро очищать железосвязывающие металлоферменты, а затем использовать этот белок для ответа на ключевые вопросы о структуре и функции, и все это в пределах учебной лаборатории. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она применима к негемовым железосвязывающим ферментам. Она доступна для студентов бакалавриата и легко внедряется в учебной лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, приобретите колонну размером 1,5 на 20 сантиметров, оснащенную выпускным отверстием для замка Люэра, верхней крышкой, которая также содержит фитинг замка Люэра, и нижней опорой для станины для удержания частиц смолы. Установите нижний фитинг замка Люэра со стопорным краном для управления потоком. Затем приобретите бутылку, содержащую 50% суспензии никель-связанной смолы нитрилоуксусной кислоты в 20% этаноле, которая ранее хранилась при температуре четыре градуса Цельсия.

Аккуратно покрутите бутылку, чтобы равномерно повторно взвесить смолу. Работая при комнатной температуре, с помощью градуированной пипетки отберите два миллиметра пульпы и перенесите ее в колонку. После того, как излишки хранительного раствора стекнут со смолы, осторожно добавьте с помощью пастеровской пипетки не менее 30 миллилитров охлажденного буфера для связывания лизиса, стараясь не повредить поверхность смолы.

Проведите буфер вниз по стенкам колонны, чтобы предотвратить разбрызгивание. Уравновесьте смолу, позволив буферу медленно стекать из колонны под действием силы тяжести в стакан для сбора. Для начала подготовьте колонну никель-NTA для добавления бесклеточных экстрактов сырой нефти, открыв запорный кран и позволив оставшемуся буферу, связывающему лизис, стекать под действием силы тяжести через никель-NTA смолу.

Когда буфер полностью опустошится и поверхность смолы обнажится, закройте запорный кран. Затем с помощью пастеровской пипетки осторожно нанесите неочищенные экстракты без клеток на смолу, стараясь не повредить поверхность. Пропустите экстракты сырой нефти вниз по стенке колонны, чтобы избежать разбрызгивания.

После того, как все сырые экстракты будут переданы в колонну, откройте запорный кран, чтобы колонна могла стекать под действием силы тяжести. Соберите 100 микролитров проточного потока для последующего анализа. Используйте короткую пластиковую трубку, чтобы подсоединить шприц с люэровским замком объемом 10 миллилитров к колпачку колонки.

Вытащите поршень шприца, а затем плотно заполните крышку колонки на верхнюю часть колонки. Осторожно сожмите поршень, собирая элюент в градуированный цилиндр, чтобы вручную оценить скорость потока. Скорость от одного до двух миллилитров в минуту совместима со смолой и экспериментальной установкой.

Осторожно увеличивайте сжатие поршня шприца по мере замедления скорости потока. Когда мениск наносимой жидкости достигнет 5-10 миллилитров над слоем смолы, снимите колпачок колонки и прикрепленный ручной насос, чтобы предотвратить попадание воздуха внутрь смолы. Дайте оставшемуся объему стечь под действием силы тяжести.

После того, как исходные экстракты закончат стекать и поверхность смолы снова обнажится, с помощью пастеровской пипетки осторожно добавьте около 30 миллилитров охлажденного буфера для промывки в колонку, стараясь не повредить поверхность смолы. Откройте запорный кран и дайте буферу для промывки стечь через колонну. Пока колонна опорожняется, наклейте этикетку на 16 микроцентрифужных пробирок для сбора фракций.

Когда буфер полностью опустошится и поверхность смолы снова обнажится, закройте запорный кран. С помощью пастеровской пипетки осторожно добавьте в колонку около 30 миллилитров охлажденного буфера для элюирования, стараясь не повредить поверхность смолы. Затем медленно откройте запорный кран, чтобы буфер элюирования вымыл белок, помеченный полигистидином, из колонки.

Соберите по одному миллилитру элюента в каждую из отмеченных микроцентрифужных пробирок. После тестирования на белок соедините содержащие белок фракции в чистую коническую пробирку. Приступайте к восстановлению ионного кофактора металла или заморозьте белок в трех миллилитровых аликвотах при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Чтобы начать восстановление металла, положите на лед трехмиллилитровую аликвоту очищенного фермента, взвешенного в элюирующем буфере. Используя объем белка в пробирке, рассчитайте необходимое количество аскорбата натрия и дитиотреитола таким образом, чтобы конечная концентрация каждого из них составляла 12,5 миллимоляров в образце. Добавьте твердый аскорбат натрия и дитиотреитол и аккуратно, но тщательно перемешайте до полного растворения.

Выложите несколько гранул одного миллилитра твердого гептагидрата сульфата железа на лист бумаги для взвешивания. Сложите бумагу поверх гранулы и раздавите ее плоской стороной металлического шпателя. Добавьте крупинку полученного порошка в трубку, содержащую белковый раствор.

Вихрь перемешать, в результате чего получится розово-розовый цвет. Закройте пробирку крышкой и инкубируйте розовый раствор на льду в течение 10–30 минут. Розовый цвет со временем потускнеет.

Для фильтрации геля используют гелевую фильтрационную колонку, наполненную 10 миллилитрами сферического полиакриламидного геля в колонке размером 1,5 на 12 сантиметров, которая также оснащена резервуаром объемом 10 миллилитров. Затем уравновесьте столбец, как указано в текстовом протоколе. Когда буфер стекает с колонны и верхняя опора кровати обнажается, закройте запорный кран.

Пипеткой нанесите трехмиллилитровый раствор железа на два восстановленных металлофермента на открытую верхнюю опору кровати. Откройте запорный кран и дайте всей трехмиллилитровой пробе войти в колонку под действием силы тяжести. Откажитесь от первых трех миллилитров элюента.

Любой розовый цвет, который образуется при работе с раствором, будет захвачен в верхней части колонны. Когда колонка перестанет капать и верхняя опора слоя обнажится, добавьте четыре миллилитра фильтрующего буфера геля и соберите четыре миллилитра элюента на 8,5 миллилитровых фракциях. После объединения белоксодержащих фракций приступают к анализу или хранению образца, как указано в текстовом протоколе.

В этом исследовании студенты очищали и впоследствии восстанавливали помеченную полигистидином негемовую железосвязывающую диоксигеназу. Анализ SDS-PAGE показывает, что меченый белок эффективно очищается. Здесь приведены собранные студентами данные об активности ферментативного действия очищенной L-допа-диоксигеназы после восстановления железом-2 и последующей фильтрации гелем.

Задержка в пять секунд перед началом сбора данных типична для студентов, использующих этот метод впервые. Стационарный анализ показывает, что кинетические параметры, определенные путем подгонки кривых прогресса, согласуются с опубликованными результатами. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что больше железа не лучше, так как слишком большое количество железа вызовет осаждение белка.

Концентрации железа в трех-пяти молярных избытках белка достаточны. Следуя этой процедуре, учащиеся могут провести дополнительные эксперименты для измерения структуры раствора, изучить фермент или субстрат-зависимую химию, чтобы ответить на дополнительные вопросы о механизме реакции.