Caenorhabditis Сито: Низкотехнологичные инструмент и методологии для сортировки мелких многоклеточных организмов
4 июля 2018 г.
Текущий протокол включает в себя методологию для сортировки и очистки соответствует возрасту населения Caenorhabditis elegans. Она использует простой, недорогой и эффективный инструмент по индивидуальному заказу для получения большой экспериментальной популяции нематод для научных исследований.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы молекулярной биологии, включая анализы, требующие определенных стадий развития C.elegans. Например, анализы уровня экспрессии генов и белков. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет точно и эффективно отбирать большое количество C.elegans по размеру тела, что облегчает использование анализов, которые обычно требуют непомерно много времени и средств.
Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они не могут выполнить этап поворота дуги или не удерживают поток раствора в центре сетки. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы стирки и переворачивания сложны для изучения. У некоторых могут возникнуть проблемы с интерпретацией и визуализацией определенных движений в тексте.
Для начала приобретите две конические трубки объемом 50 мл с крышками, затем с помощью ступенчатого сверла удалите центр с внутренней кромки крышек. При необходимости используйте напильник, наждачную бумагу или вращающийся инструмент для очистки и шлифовки краев и верха крышек. Затем вырезаем диск из капроновой мононити из плетеной сетки, чуть меньше диаметра крышки.
Текстурируйте верхние поверхности крышек и очистите их этанолом. Дав крышкам высохнуть, нанесите цианоакрилатный клей на верхние поверхности обеих крышек. Далее уложите сетчатый диск из мононити на одну приклеенную крышку.
Переверните вторую крышку поверх сетки, и плотно прижмите крышки друг к другу. После того как первый слой клея высохнет, нанесите щедрое кольцо цианоакрилатного клея вокруг внешнего зазора между крышками. Затем пометьте фильтр соответствующим размером пор ячеи.
Сначала поместите сито на коническую пробирку с маркировкой объемом 50 мл. Затем пипеткой проведите солевой раствор через центр сита до тех пор, пока не образуется капля, которая сойдет и не будет капать из центра фильтра. Используя буфер M9, смойте популяцию C.elegans со шнековой пластины, затем используйте стеклянную пастерную пипетку для переноса буфера, содержащего червей, на верхнюю сторону сетки моноволокна.
Работая в центре сетки, промойте фильтр буфером M9, повторите этот шаг промывки по мере необходимости, чтобы пропустить все бактерии и более мелких червей через сетку. Далее прикрепите новую коническую трубку объемом 50 мл к верхней части сита, ранее собранные червячки размером больше пор в сетке будут обращены внутрь новой трубки. Снимите трубку для отходов и быстро переверните сито.
Затем промойте сетку с буфером M9 в новую пробирку для сбора. Дайте собранным червям отстояться в течение примерно одной минуты, затем осторожно отсадите буферный раствор подальше от гранул червей. С помощью стеклянной пастеровской пипетки создайте капельки червей на пластине NGM и дайте им высохнуть.
Наконец, промойте сито водой обратного осмоса и этанолом. После того как сито высохнет, храните его в чистой таре впрок. Выбросьте сито, когда оно приобретет обвисший вид.
В этом протоколе было сконструировано сито для сортировки и очистки популяций C.elegans соответствующего возраста. Животные в группе обработки ситом демонстрировали нормальный и спонтанный характер движений на протяжении всей взрослой жизни. Кроме того, в группах подбора и сита не было выявлено существенных различий в скорости насоса глотки.
Животные в группе сита также нормально реагировали на передний или задний механический раздражитель по сравнению со всеми группами лечения в любой из дней испытаний. Наконец, сравнивали плодовитость групп лечения; Использование сита не оказало существенного влияния на количество потомства по сравнению с группой обработки Pick. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за десять минут.
При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нужно работать в центре области сетки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собирать и правильно использовать сито Caenorhabditis для сортировки червей по размеру тела.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается методика сортировки и очистки популяций Caenorhabditis elegans одного возраста с использованием инструмента собственного изготовления. Это позволяет исследователям эффективно и экономично получать большую экспериментальную популяцию.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Молекулярная биология
- Биология развития
Теоретические сведения
- Определенные стадии развития C.elegans имеют решающее значение для различных анализов.
- Анализы могут включать изучение уровней экспрессии генов и белков.
- Традиционные методы могут быть трудоемкими и дорогостоящими.
- Визуальные демонстрации необходимы для понимания методологии.
Цель исследования
- Обеспечить эффективный метод отбора C.elegans по размеру тела.
- Облегчить проведение анализов, требующих определенных стадий развития.
- Повысить доступность данной методики для исследователей, ранее не использовавших этот метод.
Используемые методы
- Специально изготовленный инструмент для сортировки нематод.
- Этап дугообразного переворачивания для эффективной промывки.
- Поддержание потока раствора в центре сетки.
- Визуальные демонстрации для облегчения обучения.
Основные результаты
- Достигнут точный отбор большого количества C.elegans.
- Метод сокращает время и затраты на проведение анализов в области молекулярной биологии.
- Улучшено понимание специфических движений благодаря визуальным пособиям.
- Повышена доступность метода для исследователей, не знакомых с данной методикой.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод сортировки C.elegans.
- Визуальные пособия имеют решающее значение для эффективного освоения данной методики.
- Эта методология может принести значительную пользу исследованиям в области молекулярной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость для руководителей
В биофармацевтических исследованиях и разработках получение синхронизированных популяций модельных организмов, таких как C. elegans, имеет решающее значение для воспроизводимого фенотипического скрининга и анализа валидации мишеней. Сито Caenorhabditis позволяет быстро и экономично проводить сортировку по размеру тела, снижая временные и ресурсные затраты на начальных этапах рабочих процессов поиска. Это повышает прогностическую уверенность в готовности анализа и приоритизации портфеля за счет обеспечения однородности биологических входных данных.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием популяций червей одного возраста для получения согласованных фенотипических показателей.
- Практическая ценность: предоставляет недорогой масштабируемый метод получения синхронизированных когорт без использования специализированного оборудования.
- Прогностическая ценность: снижает биологическую вариативность в анализах, повышая надежность данных для снижения рисков при выборе мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем выделения конкретных стадий развития.
- Практическая ценность: Стандартизация подготовки червей, что повышает воспроизводимость результатов между планшетами для анализа и в рамках кампаний по скринингу.
- Масштабируемость: Обеспечение потребностей высокопроизводительного анализа за счет быстрой обработки больших популяций червей менее чем за десять минут.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает сохранение фенотипической точности от этапа открытия до доклинической валидации за счет сохранения показателей подвижности, стрессового ответа и плодовитости.
- Снижение механистических рисков: позволяет надежно оценивать уровни экспрессии генов и белков в синхронизированных популяциях, что способствует согласованию биомаркеров.
- Продвижение с учетом рисков: облегчает принятие решений о продолжении или прекращении исследований («go/no-go»), предоставляя стабильные входные данные модельной системы для профилирования эффективности и токсичности.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Сито для Caenorhabditis применяется на этапе от ранних открытий до идентификации соединений-лидеров, в частности, оно обеспечивает готовность методов анализа и воспроизводимость скрининга при проведении фенотипического анализа на базе C. elegans.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, обеспечивая получение однородных популяций червей для уточнения сигнальных путей и функционального скрининга.
- Скрининг: обеспечивает готовность к проведению анализа за счет сортировки по размеру, гарантируя единообразие размеров и стадий развития червей для надежной оценки соединений.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные после разделения по размеру, что дает возможность сравнивать условия на разных стадиях развития с меньшим уровнем шума.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет сохранения ключевых показателей здоровья (подвижности, стрессового ответа, плодовитости) после сортировки, что подтверждает валидность биомаркеров.
- Корпоративное использование: служит многократно используемым инструментом, не требующим частого обслуживания, для различных групп и проектов, способствуя стандартизации работы с модельными организмами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов за счет снижения механистической неопределенности в фенотипических анализах.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов подготовки червей.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки, эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах за счет раннего выявления проблем.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе надежных данных модельной системы, специфичных для конкретной стадии.
Особенности реализации
- Требуются базовые лабораторные навыки сборки сита и работы с растворами.
- Необходим доступ к коническим пробиркам, нейлоновой сетке, цианоакрилатному клею и стандартным буферам (M9, физраствор).
- Требуется междисциплинарное обучение правилам работы с сеткой и технике переворачивания для обеспечения воспроизводимости результатов.
- При адаптации метода следует учитывать выбор размера пор сетки для целевых стадий развития червя, а также совместимость с различными системами NGM или жидких культур.
- Практические ограничения включают возможный провис сетки со временем, что требует ее периодической замены для поддержания точности сортировки.
