Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза

Этот метод может помочь ответить на такие вопросы, как сколько рибонуклеотидов включено в зарождающуюся, ведущую и отстающую цепь ДНК в геноме. Хотя этот метод может предоставить количественную и качественную информацию о плотности рибонуклеаотидов в геноме дрожжей, он также может быть применен к другим системам, таким как геномы млекопитающих. Электрофорез в щелочном геле обеспечивает полуколичественное представление о включении рибонуклеотидов во весь геном, а специфический южный блоттинг цепи позволяет повысить чувствительность и количественную оценку в определенном геномном локусе.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте шесть микролитров одного молярного гидроксида калия в каждый образец свежеприготовленной геномной ДНК дрожжей и инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия в течение двух часов. Через два часа инкубируйте образцы на льду в течение пяти минут. Затем добавьте к каждому образцу четыре микролитра 6-6 щелочных буферов для загрузки ДНК.

Нанесите щелочной гель, состоящий из одного процента агарозы, 50 миллимолярного гидроксида натрия и одного миллимолярного EDTA pH 8, с помощью гребня, который позволяет загружать 24 микролитра образца ДНК на одну дорожку. Быстро раскрутите пробирки с образцами. Загрузите в щелочной агарозный гель всего 24 микролитра каждого образца.

Включите соответствующий маркер размера ДНК. Электрофорез при 30 вольт в течение 30 минут. Затем снизьте напряжение до 10 вольт и электрофоресируйте в течение 18 – 20 часов.

На следующий день нейтрализуйте гель. Погрузите гель в нейтрализационный буфер один и инкубируйте при комнатной температуре с легким перемешиванием в течение 45 минут. Замените смесь нейтрализационного буфера на свежую буферную.

И высиживать еще 45 минут. Чтобы окрасить ДНК, замочите нейтрализованный гель в 200 миллилитрах воды, содержащей один к 10000 разведение сыбр золота при комнатной температуре с легким встряхиванием в течение двух часов. Визуализируйте ДНК с помощью УФ-трансиллюминатора.

ДНК щелочного геля будет перенесена на положительно заряженную нейлоновую мембрану за счет капиллярного действия. Сначала замочите щелочной гель при комнатной температуре на 15 минут в щелочном буфере для переноса. Затем кратковременно смочите нейлоновую мембрану водой и замочите ее в щелочном буфере на пять минут.

Установите передаточную платформу, перевернув три стеклянных стакана объемом 100 миллилитров в стеклянной форме для выпечки, размер которой немного больше агарозного геля. Установите стеклянную тарелку поверх стеклянных мензурок. Накиньте на стеклянную пластину два больших листа бумаги для хроматографии MMCHR.

Налейте щелочной буфер на хроматографическую бумагу и наполовину заполните стеклянную чашку. Разгладьте пузырьки с помощью стеклянной пипетки объемом пять миллилитров. Сверху нанесите агарозный гель.

Опять же, разглаживая пузыри. Окружите все края геля парапленкой. Налейте на гель небольшое количество щелочного буфера для переноса.

Поместите предварительно смоченную капроновую мембрану поверх геля и разгладьте пузырьки. Положите два листа хроматографической бумаги, вырезанные по размеру агарозного геля. Поместите их поверх мембраны и разгладьте любые пузырьки.

Положите большую стопку бумажных полотенец поверх бутерброда для переноса и осторожно положите стеклянную тарелку поверх бумажных полотенец. Добавьте сверху утяжеленный предмет и дайте переносу продолжаться при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день аккуратно разберите стек переводов.

Замочите мембрану при комнатной температуре в нейтрализационном буфере на 15 минут. Сшивайте ДНК с заряженной нейлоновой мембраной с помощью УФ-сшивателя. Используйте настройку автоматического перекрестного связывания.

Перед началом процедуры гибридизации подготовьте зонд с радиоактивной меткой, как описано в текстовом протоколе. Скатайте смоченную мембрану в гибридизационную трубку и добавьте 25 миллилитров свежеприготовленного гибридизационного буфера. Инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия с вращением в гибридизационной печи в течение одного-двух часов.

Аккуратно слейте раствор и добавьте 25 миллилитров гибридизационного буфера плюс зонд. Инкубировать при температуре 65 градусов Цельсия в течение от 16 до 18 часов с вращением. Далее слейте раствор в контейнер с радиоактивными отходами.

Добавьте фосфатный раствор для промывки STS один в гибридизационную трубку и вращайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Таким образом, выполните пять стирок по пять минут каждое с фосфатным раствором STS для промывки. После пятого промывки фосфатным раствором для промывки СТС один раз промыть мембрану два раза фосфатным раствором для промывки СТС, два раза по 15 минут каждый раз при 65 градусах Цельсия с вращением.

С помощью пинцета удалите мембрану из гибридизационной трубки и поместите мембрану в открытый пластиковый протектор рукава. Закройте и приложите к пластине для визуализации. При необходимости зачистите и повторно прощупайте кляксу другим зондом.

Для стриппинга налейте на мембрану 25 миллилитров 50-процентного раствора формамида 2XSSPE и выдерживайте при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух часов. Слейте раствор в контейнер с радиоактивными отходами. Добавьте фосфатный раствор для промывки STS два раза в гибридизационную трубку и вращайте при температуре 65 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Проверьте мембрану с помощью счетчика Гейгера, чтобы подтвердить отсутствие сигнала, прежде чем выполнять прегибридизацию и гибридизацию, как было показано ранее. Эти изображения геля содержат геномную ДНК дрожжей, обработанную гидроксидом калия или без него, и показывают, что клетки, лишенные RNH2, сохраняют больше рибонуклеотидов в геноме. Вариант M644L полимеразы 2 снижает способность включать рибонуклеотиды, в то время как мутант M644G включает больше рибонуклеотидов, чем полимераза дикого типа.

Щелочной агарозный гель может быть дополнительно исследован с помощью специфического анализа южного блоттинга. В этом примере зонды отжигают до зарождающейся ведущей цепи ДНК в репортерном гене URA3, который был вставлен близко к ARS306 в двух противоположных ориентациях. Репрезентативные результаты саунтер-блоттинга с использованием специфических зондов зарождающейся ведущей цепи демонстрируют картину фрагментации ДНК, вызванную расщеплением щелочи на рибонуклеотидах и зарождающихся ведущих цепях ДНК у штаммов дикого типа и в штаммах, экспрессирующих варианты полимераз альфа, дельта и эпсилон, которые являются неразборчивыми в инкорпорации рибонуклеотидов.

На этом графике показана количественная оценка радиоактивного сигнала по долям от общего количества в каждой полосе от южного блота. При попытке проведения процедуры важно помнить о том, что всегда следует использовать свежевыделенную ДНК из клеток лица. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области репарации ДНК к количественной оценке плотности и цепи, в которую рибонуклеотиды были включены репликативными ДНК-полимеразами.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование гидролированного конца или HydEn-seq, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как расположение рибонуклеотидов в геноме. Не забывайте, что работа с радиоактивными материалами может быть чрезвычайно опасной, и всегда следует принимать меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения верстака и оборудования во время выполнения этой процедуры.