Использование мыши Splenocytes оценить патоген связанные молекулярные модели влияние на экспрессию генов будильник

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и хронобиологии, например, как микробные компоненты изменяют молекулярные часы. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она проста в исполнении, оценивается влияние различных микробных компонентов на молекулярные часы, а также в том, что она обладает высокой воспроизводимостью. Чтобы начать протокол, приготовьте питательную среду путем добавления фетальной бычьей сыворотки в RPMI 1640 до конечной концентрации 10%Приготовьте 10 миллилитров провокационной среды для каждого из тестируемых PAMPS в 50-миллилитровых пробирках, добавив указанную питательную среду PAMP.

Сбрызните заранее подготовленный ствол мыши 70%-ным этанолом и протрите бумажным полотенцем. Положите мышь на заднюю сторону, слегка наклонив ее на правую сторону. Затем отрежьте шерсть ножницами для препарирования вдоль левой стороны мыши, примерно на полпути между передними и задними лапами.

С помощью щипцов захватите брюшину и аккуратно сделайте разрез, не повредив селезенку. Удалите селезенку с помощью щипцов и поместите ее в стерильную 50-миллилитровую пробирку, содержащую примерно 10 миллилитров питательных сред на льду. Затем переложите селезенку с двумя миллилитрами питательной среды в маленькую стерильную чашку Петри.

Гомогенизируйте селезенку, измельчив ее между матовой частью двух стерильных матовых предметных стекол. После полной гомогенизации пипеткой нанесите два миллилитра питательной среды, содержащей спленоциты, через нейлоновое сетчатое фильтр размером 40 микрон в пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте восемь миллилитров среды для холодных культур в каждую из 50 миллилитров пробирки, содержащей спленоциты, чтобы общий объем составил 10 миллилитров на пробирку.

Определяют количество клеток на миллилитр с помощью гемоцитометра. Добавьте примерно один раз по 10-шестую клетку на лунку к шестилуночным культуральным планшетам. После добавления клеток добавьте в клетки три миллилитра питательной среды или три миллилитра провокационной среды.

Затем инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех часов. Соскребите клетки со дна лунки с помощью наконечника для пипетки объемом 1 000 микролитров, прикрепленного к микропипетке P1000. С помощью того же наконечника пипетки перенесите среду, содержащую клетки, в пробирку объемом 15 миллилитров.

Гранулируйте ячейки при 167 умноженных на г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и промойте клеточную гранулу пятью миллилитрами PBS. После повторного гранулирования клеток в 167 раз г в течение пяти минут удалите надосадочную жидкость и добавьте к клеточной грануле 600 микролитров буфера для лизиса.

Выделите РНК из спленоцитов с помощью набора для экстракции РНК в соответствии с инструкциями производителя и выполните дополнительное расщепление ДНК на колонке. Синтезируйте кДНК для каждого из образцов с помощью набора для обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя. Используйте 10 микролитров РНК для каждого из образцов в общем объеме реакции 20 микролитров.

Извлеките мРНК из нескольких контрольных образцов в пробирку объемом 0,5 миллилитра, чтобы подготовить кДНК, которую можно использовать для стандартной кривой при выполнении количественной ПЦР. Добавьте 10 микролитров мастер-микса 2X обратной транскриптазы. По завершении обратной транскрипции добавьте в реакционную трубку 10 микролитров воды, которая служит начальной концентрацией в ряду разбавления для стандартной кривой.

Выполните десятикратное разбавление, добавив 45 микролитров воды в четыре пробирки объемом 0,5 миллилитра, обозначенные как 10 в минус один, 10 в минус два, 10 в минус три и 10 в минус четыре. Добавьте пять микролитров начальной концентрации один во вторую пробирку, 10 к минусовому, используя микропипетку Р20. Перемешайте с помощью пипетирования вверх и вниз несколько раз, затем перелейте пять микролитров из пробирки 10 до минус одной пробирки в пробирку, обозначенную 10 до пробирки минус два, и перемешайте.

Перенесите пять микролитров с помощью микропипетки P20 из пробирки 10 в пробирку с отметкой 10 до минус трех и перемешайте. Наконец, перенесите пять микролитров с помощью микропипетки P20 из пробирки 10 в минус три в трубку, обозначенную как 10 в минус четыре, и перемешайте. Приготовьте реакцию таким образом, чтобы она содержала 0,5 микролитра праймерного пробного анализа, пять микролитров мастер-смеси экспрессии генов, два микролитра воды и 2,5 микролитра кДНК.

Пипетируйте образцы РНК в 96-луночный планшет для количественной ПЦР. Инкубируйте праймерные зонды для различных молекулярных часовых генов и включите анализ для эндогенного контроля, а затем загрузите его в машину для количественной ПЦР для определения относительного количественного определения уровней мРНК. В экспериментальной установке выберите количественное определение, относительную стандартную кривую и химический состав TaqMan.

Далее изменяем объем реакции до 10 микролитров. Введите соответствующую информацию в схему расположения табличек. КПЦР проводили на выделенной РНК для оценки относительных уровней экспрессии генов молекулярных часов, clock, Per2, Dbp и Rev-erb alpha.

После провокации PAMP уровни экспрессии часов существенно не отличались по сравнению с контрольными клетками. Уровни экспрессии Per2 были значительно повышены в клетках с ЛПС и ODN1826 по сравнению с контрольной группой. ЛПС был единственным ПАМФ, который изменял экспрессию Rev-erb альфа, поскольку уровни мРНК были значительно ниже, чем в контрольной группе.

Значительно более низкие уровни мРНК для Dbp наблюдались после контакта с каждым из PAMP по сравнению с контрольной группой. После этой процедуры молекулы, отличные от PAMP, могут быть использованы для оценки их влияния на молекулярные часы в спленоцитах.