Экстракции ДНК высокой пропускной способностью и генотипирования 3dpf личинки у рыбок данио путем отсечения Fin

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биомедицинской сфере. Например, использование рыбок данио для создания генетических моделей болезней. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить раннюю идентификацию генотипов с помощью простого высокопроизводительного метода.

Хотя этот метод может обеспечить обширные исследования с использованием моделей генетической эпилепсии на рыбках данио, он также может быть применен к другим моделям генетических заболеваний и любому типу исследований мутаций. Как правило, у людей, плохо знакомых с этим методом, могут возникнуть трудности, так как рассечение личиночного плавника должно быть точно выполнено в пределах пигментной щели хвоста. Прежде чем приступить к обрезке плавников личинок данио-рерио, подготовьте поверхность для вскрытия.

Наклейте кусок автоклавного скотча на внутреннюю поверхность девятисантиметровой крышки чашки Петри и расположите крышку под стереомикроскопом. Подготовьте наконечник для пипетки P1000 для размещения личинки с тремя dpf с минимальным напряжением, отрезав конец наконечника пипетки диаметром два миллиметра. Поместите через три-пять дней после оплодотворения (dpf) личинок данио-рерио в чашку Петри и обезболите 1,5 миллимолярным трикаином в 1x E3 эмбриональной среде.

С помощью модифицированной микропипетки P1000 соберите и обезболите личинку данио-рерио и поместите ее на ленту автоклава на крышке чашки Петри. Удалите излишки раствора трикаина, окружающие личинку. Участок должен быть как можно более сухим, чтобы успешно разрезать и подхватить плавник, но все же влажным для обеспечения приживаемости.

Чтобы избежать кровотечения и обеспечить выживание личинки при клипировании плавников, рассечение должно происходить в пределах пигментного промежутка. Дистальнее до предела циркуляции крови, как указано на этом изображении. Работая под стереомикроскопом, используйте микроскальпель для разрезания хвостового плавника.

Во время разреза надавливайте постоянно, но мягко вниз, чтобы не повредить хорду. Визуализируйте разрезанный плавник под микроскопом и расположите деталь на вершине кончика лезвия микроскальпеля. Поместите микроскальпель, содержащий плавник, на поверхность небольшого листа фильтровальной бумаги.

Из-за наличия меланоцитов в пересеченной ткани плавник проявляется в виде небольшого черного пятна. Чтобы обеспечить успешное извлечение ДНК, важно, чтобы на фильтровальной бумаге была отмечена черная точка, обозначающая место плавника, прежде чем продолжить выполнение протокола. С помощью ножниц и пинцета перенесите фильтровальную бумагу, содержащую ребро, в лунку 96-луночного ПЦР-планшета, содержащего 25 микролитров 50 миллимолярного раствора гидроксида натрия.

Далее подготовьте 96-луночный планшет для культуры тканей с плоским дном, пронумеровав лунки в соответствии с этикеткой ПЦР-планшета. С помощью модифицированной пипетки P1000, наполненной 200 микролитрами свежей среды эмбриона e3, осторожно соберите личинку данио-рерио, используя легкое давление. Дозируйте личинку в 96-луночном планшете в том же номере, что и планшет для ПЦР.

Убедитесь, что фильтровальная бумага, содержащая ребро, хорошо погружена в раствор. Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между каждым разрезом, очистите лезвие микроскальпеля и пинцета, погрузив в 70% раствор этанола. Протрите лезвие чистой бумажной салфеткой или салфеткой.

Когда все личинки будут обрезаны, храните личинок в 96-луночной пластине при температуре 28 градусов Цельсия до тех пор, пока их генотипы не будут идентифицированы. Начните эту процедуру с герметизации 96-луночного ПЦР-планшета, содержащего ребристые части, и центрифугирования образцов при 1000-кратном G в течение одной минуты. Убедитесь, что вся фильтровальная бумага погружена в раствор гидроксида натрия.

Для лизиса тканей нагрейте образцы в термоамплификаторе при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем следует охлаждение до четырех градусов Цельсия в течение 10 минут. Далее добавьте в каждый образец шесть микролитров 500 миллимолярного трис-HCL pH8.0.

Сделайте образцы вихревыми. Кратковременно центрифугируйте планшет при 1500 умноженных на G в течение пяти минут при комнатной температуре. Чтобы извлечь геномную ДНК с помощью этого метода, обрежьте ребро, как показано ранее, но добавьте фильтровальную бумагу с обрезанным ребром в лунку 96-луночного ПЦР-планшета, содержащего 30 микролитров 5%-ной хелатирующей смолы.

После того, как все ребристые части будут обрезаны, запечатайте 96-луночный ПЦР-планшет и кратко центрифугируйте образцы, чтобы убедиться, что вся фильтровальная бумага погружена в хелатирующую смолу. Нагрейте образцы в термоамплификаторе до 95 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем охладите до четырех градусов Цельсия в течение 10 минут. Кратковременно центрифугируйте образцы, чтобы гранулировать гранулы смолы и получить ДНК в суспензии.

Мультиплексный ПЦР-анализ позволит провести различие между гомозиготными мутантами, гетерозиготами и личинками дикого типа. Настройте реакцию ПЦР, как указано в текстовом протоколе. Проведите ПЦР-реакции в 96-луночном термоамплификаторе.

Приготовьте 1%-ный агарозный гель в буфере бората натрия, окрашенный 1x гелевым красным. Чтобы облегчить процесс, по возможности используйте гелевую систему, совместимую с многоканальными пипетками, чтобы обеспечить более высокую пропускную способность за счет сокращения времени загрузки образцов. Запустите гель в 1x буфере бората натрия при напряжении 250 вольт в течение 15 минут.

Визуализируйте гель под ультрафиолетовым светом, чтобы обеспечить различие различных генотипов. Начните этот анализ с подготовки двух гелей с 12% полиакриламидом с использованием 1,5-миллиметровой распорной пластины и 15 гребней для образцов, как описано в текстовом протоколе. Используйте вертикальную систему электрофореза и 1x TBE буфер в качестве рабочего буфера.

После выполнения ПЦР, как описано в текстовом протоколе, нагрейте продукты ПЦР при температуре 94 градуса Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите до четырех градусов Цельсия в течение 10 минут. Загрузите 10 микролитров на образец ПЦР и восемь микролитров маркера молекулярной массы. Запускайте гель при напряжении 150 вольт в течение одного часа или до тех пор, пока маркер молекулярной массы почти не достигнет линии стопы стеклянной пластины.

Визуализируйте гель под ультрафиолетовым светом, чтобы обеспечить различие различных генотипов. Этот протокол был использован для генотипирования потомства гетерозиготного скрещивания, в котором мутантная подвздошная кишка имеет вставку 5 пар оснований в первый экзон покрытия гена aldh7a1. Ожидаемым результатом ПЦР-амплификации как дикого типа, так и мутантной подвздошной кишки является ампликон 434 BP.

Полоса 293 BP возникает в результате амплификации мутантной подвздошной кишки, а полоса 195 BP получается для подвздошной кишки дикого типа. Анализ реакций ПЦР на геле бората натрия 1%% выявил генотипы дикого типа во втором и шестом дорожках, гетерозиготные генотипы в третьей, четвертой и пятой дорожках и гомозиготный мутантный генотип в первой дорожке. Различные мутации были генотипированы с помощью гетеродуплексного анализа плавления.

Мутантные подвздошные кишки plpbpot101 и plpbpot102 гена plpbp допускают сдвиг кадра и раннюю стоп-кодон. После денатурации и отжига фрагменты ПЦР у гетерозиготных животных будут содержать гетеродуплексную и гомодуплексную ДНК, которые легко отделяются и визуализируются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Сложные гетерозиготные мутантные генотипы были идентифицированы во втором, четвертом и восьмом дорожках, гетерозиготные генотипы — в третьей, шестой, седьмой, девятой и десятой дорожках, а генотип дикого типа — в пятой полосе.

После того, как вы освоитесь, обрезание плавников 96 личинок с помощью этой техники может быть выполнено менее чем за час, если все сделано правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как объединение личинок данио-рерио одного и того же генотипа для экстракции ткани, которые должны ответить на дополнительные вопросы, такие как исследование биомаркеров и модели заболеваний. После своего развития этот метод проложил путь к исследованиям в области моделей метаболической эпилепсии для изучения физиологии пути заболевания у рыбок данио.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как правильно генотипировать трехдневных личинок данио-рерио путем микрорассечения хвостового плавника.