Крупномасштабные трехмерных изображений клеточной организации коры головного мозга мыши

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронауки, такие как анализ структуры и функции неокортекса. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет выявить масштабную трехмерную структуру в мозге. Хотя этот метод может дать представление о неокортексе, он также может быть применен к другим нервным системам, таким как спинной мозг.

Чтобы ввести индикатор в мост взрослых мышей, сначала наберите один микролитр меченой флуоресцентно меченной субъединицы холерного токсина B в шприц Гамильтона 26-го калибра. Поместите инжекторный насос на шприц, затем поместите шприц и насос на держатель инструмента манипулятора на стереотаксическом инструменте. Наклоните манипулятор на 12 градусов кзади от вертикальной оси.

После этого поместите мышь на стереотаксический инструмент. С помощью лезвия бритвы удалите ее волосы, чтобы предотвратить инфицирование. Затем разрежьте 10 миллиметров кожи головы так, чтобы были видны брегма и лямбда.

Введите 0,1 миллилитра 1%-ного лидокаина с помощью пипетки. Установите угол наклона головки, отрегулировав вертикальное положение мундштука на стереотаксическом инструменте так, чтобы брегма и лямбда имели одинаковый уровень Z. Далее отрегулируйте положение манипулятора, сдвинув его на стереотаксический инструмент так, чтобы кончик шприца находился близко к брегме.

Запишите положение манипулятора. Втяните шприц, переместив держатель инструмента на манипуляторе. Впоследствии переместите манипулятор на 5,4 миллиметра кзади и на 0,4 миллиметра вбок.

Продвинуте шприц так, чтобы наконечник был близко к точке входа на черепе, затем втяните шприц и отметьте точку входа. В отмеченном месте просверлите отверстие диаметром примерно один миллиметр. Вставьте наконечник шприца через отверстие так, чтобы глубина наконечника была на 6,9 миллиметра больше, чем измеренная на брегме.

Затем введите один микролитр индикаторов с помощью помпы со скоростью 0,2 микролитра в минуту. После инъекции извлеките шприц из головного мозга. При необходимости покройте обнаженный мозг небольшими фрагментами микрофибриллярного гемостата и мгновенного клея.

Протрите открытый мозг физиологическим раствором, чтобы предотвратить инфицирование, и зашите кожу головы. Далее снимите мышь со стереотаксического инструмента. Дайте мыши восстановиться после анестезии в инкубаторе при температуре 30 градусов Цельсия в течение примерно часа.

Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Верните мышь в компанию других животных после того, как она полностью восстановится. Чтобы собрать мозговую ткань, разрежьте кожу головы с помощью ножниц, чтобы обнажить череп.

Затем разрежьте среднюю линию обнаженного черепа с помощью ножниц. Затем удалите череп с помощью щипцов. Если необходимо отметить положение брегмы и лямбды, сначала удалите одну сторону черепа.

Затем введите тонкие вольфрамовые иглы в мозг в местах расположения брегмы и лямбды, после чего удалите оставшийся череп. Затем поместите образец мозга на вибратомную платформу. Разрежьте срезы толщиной до 500 микрометров в PBS при комнатной температуре.

В ходе этой процедуры переложите срезы в пятимиллилитровую пластиковую трубку, содержащую четыре миллилитра раствора Scale S0. Затем выдержите их в течение 12 часов, слегка встряхивая при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 12 часов извлеките раствор из пробирки с помощью пипетки и добавьте четыре миллилитра раствора Scale A2.

Выдерживайте ломтики в течение 36 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия. Через 36 часов достаньте раствор из пробирки и добавьте четыре миллилитра раствора Scale B4. Выдерживайте ломтики в течение 24 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 24 часа достаньте раствор из пробирки и добавьте четыре миллилитра раствора Scale A2. Выдерживайте ломтики в течение 12 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия. Через 12 часов достаньте раствор из тюбика и добавьте четыре миллилитра PBS.

Выдерживайте ломтики в течение шести часов, осторожно встряхивая при комнатной температуре. Впоследствии аккуратно удалите дольки в двухмиллилитровую пластиковую трубочку. Инкубируйте их с первичным антителом в одном миллилитре раствора AB Scale в течение 48-72 часов при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием.

После аккуратно удалите дольки в пятимиллилитровую пластиковую трубку. Инкубируйте их в четырех миллилитрах раствора AB Scale в течение двух часов два раза при комнатной температуре с легким встряхиванием. После аккуратно выньте ломтики в двухмиллилитровую пластиковую трубку.

Инкубировать с флуоресцентно меченным вторичным антителом в одном миллилитре раствора AB Scale в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием. Осторожно извлеките срезы в пятимиллилитровую пластиковую пробирку, содержащую четыре миллилитра раствора антитела Scale, и инкубируйте срезы в течение шести часов, осторожно встряхивая при комнатной температуре. Достаньте раствор и добавьте четыре миллилитра раствора AB Scale и выдержите срезы в течение двух часов два раза, слегка встряхивая при комнатной температуре.

Далее достаньте раствор и добавьте четыре миллилитра 4%-ной PFA и выдержите дольки в течение одного часа, слегка встряхивая при комнатной температуре. Затем достаньте раствор и добавьте четыре миллилитра PBS и выдержите дольки в течение одного часа, осторожно встряхивая при комнатной температуре. Удалите раствор и добавьте четыре миллилитра раствора Scale S4 и инкубируйте ломтики в течение 12 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем поместите распорку на предметное стекло и поместите срезы в прокладку и погрузите срезы в раствор Scale S4. Закройте дистанционную рамку покровным стеклом. Налейте немного воды на покровное стекло и сфотографируйте срезы с помощью конфокальной или двухфотонной микроскопии с объективом дальнего действия с погружением в воду.

В этом исследовании нейроны корковой проекции были помечены зеленым цветом по экспрессии tdTomato у трансгенных мышей Tlx3-cre AI9, а субцеребральные проекционные нейроны пурпурного цвета были визуализированы путем введения ретроградного индикатора CTB488 в мост в возрасте семи недель. Это вид сверху, показывающий приблизительное положение областей коры головного мозга. Вот косые изображения флуоресценции CTB488, показывающей субцеребральные проекционные нейроны, и флуоресценции tdTomato, показывающей корковые проекционные нейроны, и это объединенное изображение.

Клеточные тела двух типов клеток были видны в широком диапазоне областей мозга, а оптические срезы показали периодические микростолбцы. На этом изображении показаны тела клеток и апикальные дендриты субцеребральных проекционных нейронов eGFP в оптическом срезе мыши Crym-eGFP, а на этом изображении показаны клетки, экспрессирующие парвальбумин, помеченные зеленым цветом, и нейроны субцеребральной проекции, помеченные пурпурным цветом путем введения CTB488 в мост мыши C57 Black 6 методом Cinbody Scale. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как обработка 3D-изображений, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как количественная характеристика мозговой организации.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии коры головного мозга к изучению новой модульной организации в мозге мыши.