Крупномасштабные трехмерных изображений клеточной организации коры головного мозга мыши
5 сентября 2018 г.
Здесь мы опишем процедуру для очистки ткани, люминесцентные маркировки и крупномасштабных изображений мыши мозговой ткани, которая, таким образом, позволяет визуализации трехмерных организации типов клеток коры головного мозга.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронауки, такие как анализ структуры и функции неокортекса. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет выявить масштабную трехмерную структуру в мозге. Хотя этот метод может дать представление о неокортексе, он также может быть применен к другим нервным системам, таким как спинной мозг.
Чтобы ввести индикатор в мост взрослых мышей, сначала наберите один микролитр меченой флуоресцентно меченной субъединицы холерного токсина B в шприц Гамильтона 26-го калибра. Поместите инжекторный насос на шприц, затем поместите шприц и насос на держатель инструмента манипулятора на стереотаксическом инструменте. Наклоните манипулятор на 12 градусов кзади от вертикальной оси.
После этого поместите мышь на стереотаксический инструмент. С помощью лезвия бритвы удалите ее волосы, чтобы предотвратить инфицирование. Затем разрежьте 10 миллиметров кожи головы так, чтобы были видны брегма и лямбда.
Введите 0,1 миллилитра 1%-ного лидокаина с помощью пипетки. Установите угол наклона головки, отрегулировав вертикальное положение мундштука на стереотаксическом инструменте так, чтобы брегма и лямбда имели одинаковый уровень Z. Далее отрегулируйте положение манипулятора, сдвинув его на стереотаксический инструмент так, чтобы кончик шприца находился близко к брегме.
Запишите положение манипулятора. Втяните шприц, переместив держатель инструмента на манипуляторе. Впоследствии переместите манипулятор на 5,4 миллиметра кзади и на 0,4 миллиметра вбок.
Продвинуте шприц так, чтобы наконечник был близко к точке входа на черепе, затем втяните шприц и отметьте точку входа. В отмеченном месте просверлите отверстие диаметром примерно один миллиметр. Вставьте наконечник шприца через отверстие так, чтобы глубина наконечника была на 6,9 миллиметра больше, чем измеренная на брегме.
Затем введите один микролитр индикаторов с помощью помпы со скоростью 0,2 микролитра в минуту. После инъекции извлеките шприц из головного мозга. При необходимости покройте обнаженный мозг небольшими фрагментами микрофибриллярного гемостата и мгновенного клея.
Протрите открытый мозг физиологическим раствором, чтобы предотвратить инфицирование, и зашите кожу головы. Далее снимите мышь со стереотаксического инструмента. Дайте мыши восстановиться после анестезии в инкубаторе при температуре 30 градусов Цельсия в течение примерно часа.
Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Верните мышь в компанию других животных после того, как она полностью восстановится. Чтобы собрать мозговую ткань, разрежьте кожу головы с помощью ножниц, чтобы обнажить череп.
Затем разрежьте среднюю линию обнаженного черепа с помощью ножниц. Затем удалите череп с помощью щипцов. Если необходимо отметить положение брегмы и лямбды, сначала удалите одну сторону черепа.
Затем введите тонкие вольфрамовые иглы в мозг в местах расположения брегмы и лямбды, после чего удалите оставшийся череп. Затем поместите образец мозга на вибратомную платформу. Разрежьте срезы толщиной до 500 микрометров в PBS при комнатной температуре.
В ходе этой процедуры переложите срезы в пятимиллилитровую пластиковую трубку, содержащую четыре миллилитра раствора Scale S0. Затем выдержите их в течение 12 часов, слегка встряхивая при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 12 часов извлеките раствор из пробирки с помощью пипетки и добавьте четыре миллилитра раствора Scale A2.
Выдерживайте ломтики в течение 36 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия. Через 36 часов достаньте раствор из пробирки и добавьте четыре миллилитра раствора Scale B4. Выдерживайте ломтики в течение 24 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия.
Через 24 часа достаньте раствор из пробирки и добавьте четыре миллилитра раствора Scale A2. Выдерживайте ломтики в течение 12 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия. Через 12 часов достаньте раствор из тюбика и добавьте четыре миллилитра PBS.
Выдерживайте ломтики в течение шести часов, осторожно встряхивая при комнатной температуре. Впоследствии аккуратно удалите дольки в двухмиллилитровую пластиковую трубочку. Инкубируйте их с первичным антителом в одном миллилитре раствора AB Scale в течение 48-72 часов при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием.
После аккуратно удалите дольки в пятимиллилитровую пластиковую трубку. Инкубируйте их в четырех миллилитрах раствора AB Scale в течение двух часов два раза при комнатной температуре с легким встряхиванием. После аккуратно выньте ломтики в двухмиллилитровую пластиковую трубку.
Инкубировать с флуоресцентно меченным вторичным антителом в одном миллилитре раствора AB Scale в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием. Осторожно извлеките срезы в пятимиллилитровую пластиковую пробирку, содержащую четыре миллилитра раствора антитела Scale, и инкубируйте срезы в течение шести часов, осторожно встряхивая при комнатной температуре. Достаньте раствор и добавьте четыре миллилитра раствора AB Scale и выдержите срезы в течение двух часов два раза, слегка встряхивая при комнатной температуре.
Далее достаньте раствор и добавьте четыре миллилитра 4%-ной PFA и выдержите дольки в течение одного часа, слегка встряхивая при комнатной температуре. Затем достаньте раствор и добавьте четыре миллилитра PBS и выдержите дольки в течение одного часа, осторожно встряхивая при комнатной температуре. Удалите раствор и добавьте четыре миллилитра раствора Scale S4 и инкубируйте ломтики в течение 12 часов, осторожно встряхивая при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем поместите распорку на предметное стекло и поместите срезы в прокладку и погрузите срезы в раствор Scale S4. Закройте дистанционную рамку покровным стеклом. Налейте немного воды на покровное стекло и сфотографируйте срезы с помощью конфокальной или двухфотонной микроскопии с объективом дальнего действия с погружением в воду.
В этом исследовании нейроны корковой проекции были помечены зеленым цветом по экспрессии tdTomato у трансгенных мышей Tlx3-cre AI9, а субцеребральные проекционные нейроны пурпурного цвета были визуализированы путем введения ретроградного индикатора CTB488 в мост в возрасте семи недель. Это вид сверху, показывающий приблизительное положение областей коры головного мозга. Вот косые изображения флуоресценции CTB488, показывающей субцеребральные проекционные нейроны, и флуоресценции tdTomato, показывающей корковые проекционные нейроны, и это объединенное изображение.
Клеточные тела двух типов клеток были видны в широком диапазоне областей мозга, а оптические срезы показали периодические микростолбцы. На этом изображении показаны тела клеток и апикальные дендриты субцеребральных проекционных нейронов eGFP в оптическом срезе мыши Crym-eGFP, а на этом изображении показаны клетки, экспрессирующие парвальбумин, помеченные зеленым цветом, и нейроны субцеребральной проекции, помеченные пурпурным цветом путем введения CTB488 в мост мыши C57 Black 6 методом Cinbody Scale. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как обработка 3D-изображений, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как количественная характеристика мозговой организации.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии коры головного мозга к изучению новой модульной организации в мозге мыши.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен детальный протокол осветления тканей, флуоресцентного маркирования и крупномасштабной визуализации тканей мозга мыши. Описанная методика позволяет исследователям визуализировать трехмерную организацию типов клеток в неокортексе, что дает ценную информацию о его структуре и функциях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Визуализация тканей
- Флуоресцентное мечение
Теоретические сведения
- Структура и функции неокортекса имеют фундаментальное значение для нейронауки.
- Понимание организации клеток может помочь в решении ключевых исследовательских вопросов.
- Данный метод может быть применен и к другим отделам нервной системы, например, к спинному мозгу.
Цель исследования
- Разработать методику для улучшения визуализации структур мозга.
- Исследовать организацию типов клеток в неокортексе.
- Создать основу, применимую для более широких исследований нервной системы.
Используемые методы
- Крупномасштабная визуализация с использованием конфокальной или двухфотонной микроскопии.
- Используемая модель включает взрослых мышей и определенные области мозга, такие как мост.
- В протоколе подробно описаны процедурные этапы инъекции трейсера и подготовки ткани.
- Критически важными этапами были инкубация в таких растворах, как Scale S0, A2, B4, и использование флуоресцентных антител.
Основные результаты
- Метод позволяет выявить крупномасштабные трехмерные структуры в тканях головного мозга мыши.
- Было достигнуто специфическое мечение проекционных нейронов коры и других типов клеток.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует надежный метод визуализации организации нейронов.
- Полученные результаты вносят значительный вклад в понимание структуры и функций неокортекса.
- Данная методология может быть адаптирована для различных целей в нейробиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание трехмерной клеточной архитектуры сложных тканей, таких как неокортекс, способствует валидации мишеней, раскрывая пространственную организацию подтипов нейронов. Эти механистические данные позволяют снизить риски при проверке терапевтических гипотез за счет прямой визуализации взаимодействия с мишенью и организации сетей в системах, релевантных для конкретных заболеваний. Данный метод обеспечивает прогностическую достоверность доклинических моделей, связывая анатомическую организацию с функциональными показателями.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования организации микроколонок в неокортексе с учетом специфики типов клеток.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямой визуализации подтипов нейронов и их пространственных взаимосвязей.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет выявления периодических функциональных модулей, значимых для воздействия препаратов на уровне сети.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующей стандартизации анализов путем сохранения трехмерной архитектуры ткани.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимых рабочих процессов визуализации с помощью стандартизированных протоколов просветления и маркировки тканей.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных областей мозга и сложных тканей благодаря сканированию с помощью моторизованного предметного столика и объективов с большим рабочим расстоянием.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: связывает данные об организации на этапе открытий с доклинической валидацией посредством моделирования систем, релевантных конкретному заболеванию.
- Механистическое снижение рисков: поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем визуализации взаимодействия с мишенью в распределенных нейронных сетях.
- Согласование биомаркеров: позволяет сопоставлять структурные фенотипы с функциональными показателями для разработки трансляционных биомаркеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки лекарственных средств — от проверки гипотез о мишенях и идентификации соединений-лидеров до доклинической валидации — путем предоставления количественных анатомических данных с пространственным разрешением.
- Биологические исследования: позволяет проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути путем выявления специфической для конкретных типов клеток организации в интактной ткани.
- Скрининг: обеспечивает готовность к проведению анализа за счет воспроизводимой подготовки тканей и количественного считывания флуоресценции.
- Аналитика: позволяет проводить сравнительный анализ с помощью трехмерной визуализации и подсчета клеток в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет сохранения архитектуры тканей, имеющей значение для заболевания, для лонгитюдного изучения.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальная платформа визуализации, применимая к различным областям мозга и сложным тканям, помимо неокортекса.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени посредством прямой визуализации организации нейронов и периодичности микроколонок.
- Операционная ценность: Гарантирует стандартизацию и воспроизводимость за счет определенных рабочих процессов по просветлению тканей, маркировке и визуализации.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), снижая механистическую неопределенность в сложных тканевых системах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков, связывая анатомические фенотипы с функциональными результатами в моделях заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области нейробиологии, подготовки тканей и флуоресцентной микроскопии.
- Зависит от наличия доступа к конфокальным или двухфотонным микроскопам с объективами с большим рабочим расстоянием и моторизованными предметными столиками.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов просветления тканей, мечения антителами и визуализации.
- При применении метода к различным модельным системам, таким как спинной мозг или суррогаты тканей человека, требуются определенные корректировки.
- Ограничено размером ткани и глубиной оптического проникновения, что может затруднить визуализацию образцов всего мозга без предварительного секционирования.
