Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области транскрипционные регулирования, такие как роль хроматина взаимодействий. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает относительно беспристрастный захват взаимодействий для локуса интереса. Хотя этот метод может обеспечить понимание промоутер усилитель взаимодействий, он также может быть применен для выявления других типов хроматина взаимодействий.

Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что это занимает несколько дней для протокола, и грунтовка дизайн требует проб и ошибок и нетипичной ориентации грунтовки. Чтобы сохранить взаимодействия хроматина в клетках выбора, пересекая связь их, добавив 9,5 миллилитров 1%электронной микроскопии класса формальдегида в PBS на 10 миллионов клеток. Инкубировать клетки во время качания в течение 10 минут при комнатной температуре.

Передача реакционной трубки на лед, чтобы утолить перекрестную реакцию связи и добавить ледяной один молярный глицин в окончательную концентрацию 0,125 молара и смешать нежной инверсии. После центрифугирования и мытья клеток в соответствии с текстовым протоколом, повторно приостановить гранулы в 125 микролитров из пяти миллимолейных EDTA с 0,5%SDS и один X ингибиторы протеазы. Инкубировать подвеску клетки на льду в течение 10 минут.

Чтобы убедиться, что клеточная лиза завершена, смешайте шесть микролитров клеток с шестью микролитров трипан синий на слайде микроскопа и накрыть крышкой скольжения. Посмотреть под микроскопом, чтобы увидеть интерьер лисяных клеток синий, и unlysed клетки белые. Для первого ограничения пищеварения добавьте 30 микролитров ферментного буфера ограничения 10 X и 27 микролитров 20%Triton X-100 к клеточной подвеске и отрегулируйте общий объем до 300 микролитров с водой.

Удалите 15 микролитер aliquot и хранить при четырех градусах по Цельсию, как непереваренный контроль. К оставшейся смеси реакции добавьте 200 соединяет энзима ограничения одного. Инкубировать на ночь при температуре, подходящей для фермента в трясущимся нагревательном блоке с 900 об/мин агитации.

На следующий день добавьте еще 200 единиц фермента и продолжайте эту инкубацию на ночь. Удалите 15 микролитер aliquot и хранить при четырех градусах по Цельсию, как переваривается контроль. Для определения эффективности пищеварения добавьте 82,5 микролитров 10 миллимоляров Tris-HCl, рН 7,5, к каждому непереваренным и переваренным элементом управления.

Добавьте 2,5 микролитров протеиназы K и инкубировать в течение одного часа при 65 градусах по Цельсию, чтобы обратить вспять связь формальдегида. Чтобы изолировать переваренную ДНК, добавьте в трубку 100 микролитров фенолового хлороформа. Смешайте несколько быстрых инверсий для удаления остаточного загрязнения белка.

Центрифуга при температуре 16 100 Г при комнатной температуре в течение пяти минут. После центрифугации перенесите aqueous фазу в новую трубку. Добавьте ацетат натрия, гликоген и 100% этанол в трубку и аккуратно перемешайте инверсией.

Инкубировать при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение одного часа, чтобы ускорить ДНК. Центрифуга трубки при 16, 100 G при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут. Удалите супернатант, а затем добавьте 500 микролитров 70% этанола для мытья гранул ДНК.

Центрифуга при температуре 16 100 Г при комнатной температуре в течение пяти минут. После удаления сверхнатантного воздуха высушите гранулы при комнатной температуре в течение двух минут, чтобы удалить остаточный этанол. Повторно приостановить сушеные гранулы в 50 микролитров нуклеазы свободной воды и приступить к определению эффективности пищеварения по ПЦР, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы подготовиться к перевязке, нагревать и активировать фермент ограничения путем инкубации трубки в течение 20 минут при температуре 65 градусов по Цельсию. Затем перенесите содержимое трубки в коническую трубку на 50 миллилитров и добавьте безклеазную воду, буфер 10 X лигазы и лигозу ДНК T4. Смешайте осторожно закрученного, и инкубировать на ночь при 16 градусов по Цельсию и продолжить, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы обратить вспять перекрестную связь добавить 15 микролитров протеиназы K и инкубировать на ночь при 65 градусах по Цельсию. На следующий день добавить 30 микролитров RNase A, и инкубировать при 45 минут при 37 градусах по Цельсию. Чтобы продолжить изоляцию хроматина, добавьте семь миллилитров фенола хлороформа и смешайте несколько быстрых инверсий.

Центрифуга трубки при температуре 3 300 Г при комнатной температуре в течение 15 минут. После центрифугации перенесите акевую фазу в новую 50-миллилитровую трубку и добавьте воду без нуклеазы, три ацетата натрия, гликоген и 100% этанола. Смешайте содержимое и инкубировать при отрицательном 80 градусов по Цельсию в течение одного часа.

После инкубации центрифуга трубки при 3 900 Г при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Удалить супернатант, а затем мыть гранулы с 10 миллилитров ледяной 70%этанола. Центрифуга при 3 300 Г при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Удалите супернатант и кратко высушите гранулы при комнатной температуре. Растворите гранулы в 150 микролитров 10 миллимолейных Трис-HCl рН 7,5 при 37 градусах по Цельсию. Хранить при отрицательных 20 градусах по Цельсию или продолжать второе ограничение пищеварения, перевязки и очистки ДНК, как описано в текстовом протоколе.

После очистки ДНК выполните ПЦР с использованием обратных праймеров ПЦР и кибер- и ROX красителей для определения количества циклов усиления для обратного усиления ПЦР неизвестных взаимодействующих последовательностей, описанных в тексте. Чтобы подготовить ДНК к секвенированию, обрезать последовательность приманки с третьим ограничением пищеварения путем переваривания одного микрограмма очищенного продукта обратного ПЦР, а также ограничение фермента монитора. Вы запустите переваренный фермент ограничения, или монитор RE, на агарозный гель концентрации, подходящий для ожидаемых фрагментов.

После того, как эффективность пищеварения была определена гель электрофорез, продолжить обратную очистку продукта ПЦР и подготовки библиотеки секвенирования, как описано в текстовом протоколе. Третье ограничение пищеварения имеет важное значение в этом протоколе для следующего поколения секвенирования кругового захвата подтверждения хромосомы. Это пищеварение обрезает приманки последовательности, которые могут облегчить определение хроматина достопримечательностей.

Электрофорез агарозного геля переваренного монитора RE показал достаточное переваривание обратного ПЦР-продукта, переваренного параллельно. После завершения четырех C секвенирования считывания были обрезаны и отображены на человеческий эталонный геном hg38, используя пакет программного обеспечения BWA. Большинство считывок выравниваются на сайтах ограничения HindiIII или Cvi'1I, прилегающих к сайтам HindiIII, как и ожидалось.

При попытке этой процедуры важно, чтобы убедиться, что ваши клетки лизированы и хроматин достаточно усваивается. После этой процедуры, другие методы, такие как хроматин иммуно осадков или CHIP, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как выявление транскрипционных факторов, участвующих в хроматин взаимодействий. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области хроматина для изучения физических сетей регулирования.