Толуидиновый синий, окрашивание смолы встроенные разделы для оценки морфологии периферической нерв

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области повреждения и регенерации периферических нервов, такие как какова морфометрия периферического нерва, сколько аксонов присутствует, каково состояние миелинизации и присутствует ли фиброзная ткань? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет визуализировать особенности нерва с высоким разрешением. Начните с того, что поместите крысу под наркозом в положение лежа на верхней части коврика для вскрытия.

Установите носовой конус для поддержания анестезии с 1-2% изофлураном. Чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии, протестируйте животных на отведение педалей и глазные рефлексы задних лап. Как только будет достигнута соответствующая глубина анестезии, сбрейте шерсть на задних конечностях и простерилизуйте выбритые участки с помощью 70% этанола.

Пальпируйте бедренную кость, чтобы определить правильное место для разреза. Бедренная кость расположена как раз проксимальнее наиболее доступного сегмента седалищного нерва. После выполнения двух-трехсантиметрового разреза на коже вдоль задней конечности от колена до большого вертела найдите плоскость между двуглавой мышцей бедра и большой ягодичной мышцей.

Затем с помощью ножниц для микродиссекции отделите нижележащую фасцию и обнажите два-три сантиметра нижележащего седалищного нерва. Используйте втягивающее устройство, чтобы увеличить зазор между двумя мышцами. С помощью тонких щипцов и ножниц по радужной оболочке глаза осторожно отделите нерв от окружающей соединительной ткани, соблюдая большую осторожность, чтобы не сдавить или не перерезать нерв.

Далее накройте оголенный нерв фиксатором Трампа и оставьте на 10 минут. При необходимости подложите марлю под заднюю ногу, чтобы улучшить угол наклона, чтобы в полость можно было добавить больше фиксатора. Снимите фиксатор через 10 минут и повторите этот шаг еще два раза.

Под рассекающим микроскопом разрежьте седалищный нерв с обеих сторон с помощью тонких ножниц для рассечения, следя за тем, чтобы не растянуть и не защемить нерв. Немедленно поместите нервные участки в 15 мл пробирки, содержащие фиксатор Трампа, и зафиксируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение одной недели, меняя фиксатор каждые 48 часов. После фиксации осторожно удалите из нерва оставшийся жир и соединительные ткани, а острым скальпелем разрежьте нерв на сегменты длиной примерно пять миллиметров.

Нервные сегменты могут быть разделены на различные помеченные трубки. Погрузите нервные сегменты в свежеприготовленный 2%-ный тетраоксид осмия на два часа. Используя набор для заделки эпоксидной смолы, приготовьте окончательную смесь для заделки.

Смешайте эпоксидную среду с раствором DDSA и смешайте эпоксидную среду с раствором NMA. Перемешивайте оба раствора не менее 20 минут с помощью магнитной мешалки. Непосредственно перед использованием соедините ускоритель DPM с раствором B, а затем объедините его с раствором A таким образом, чтобы конечная пропорция ускорителя составляла от одной целой 5 целых до 2% от общего объема.

Перенесите нервные сегменты в одну точку пятимиллилитровой трубки и после промывания PBS запустите процесс обезвоживания путем замены PBS на возрастающие концентрации ацетона и дистиллированной воды на 10 минут каждая, затем в 100% ацетон три раза по 10 минут каждая. Одним из критических этапов является обезвоживание тканей. Вода и смола не будут взаимодействовать, поэтому любая оставшаяся в ткани вода не будет проникать смолой, оставляя отверстия в срезе, лишенные гистологических качеств.

Для инфильтрации смолы сначала поместите нервные сегменты в смесь смеси для встраивания и 100% ацетона один к одному на 30 минут. Через 30 минут переведите сегменты в смесь для заделки и 100% ацетона в соотношении два к одному на 30 минут. Поместите нервные сегетации в формы для встраивания силиконовой резины и аккуратно нанесите смолу поверх нервов, стараясь покрывать весь нервный сегмент, избегая при этом пузырьков воздуха.

Оставьте смолу полимеризоваться при температуре 60 градусов Цельсия на ночь. Поместите смоляной блок со встроенным нервом в держатель ультрамикротома трапециевидной стороной вверх. При просмотре через ультрамикротомный прицел используйте однолезвийное лезвие, чтобы обрезать излишки смолы, окружающей нервную ткань.

Не проникайте в продольную поверхность нервного сегмента, которую можно узнать по темному окрашиванию тетраоксидом осмия. С помощью простого стеклянного ножа на ультрамикротоме сделайте несколько поперечных сечений, чтобы обнажить равномерное поперечное сечение поверхности нерва. Как только это будет сделано, переключитесь на стеклянный нож с лодкой, наполненной дистиллированной водой комнатной температуры, и отрегулируйте ультрамикротом до одного-двух микрон, чтобы нарезать тонкие срезы.

С помощью металлической петли перенесите плавающие тонкие пряди с лодки для стеклянного ножа на каплю деионизированной воды на стеклянном предметном стекле. Еще одним важным этапом является перенос тонкого сечения со стеклянного ножа на предметное стекло. Эти тонкие срезы очень хрупкие и могут сломаться или сложиться.

После секционирования просушите секции на предметных стеклах, несколько раз проведя слайдом по пламени, следя за тем, чтобы секции не перегревались. Предметные стекла можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней, если сразу не окрашивать толуидином синим. Чтобы окрашивать участки нерва, с помощью пластиковой пипетки или микропипетки добавьте каплю раствора толуидина синего цвета в верхнюю часть отделов нерва.

Через 20-30 секунд смойте все излишки раствора толуидинового синего, осторожно опустив предметные стекла в банку с деионизированной водой, повторяя три-четыре раза, пока срезы не станут чистыми. Сушите предметные стекла не менее 15 минут при температуре 60 градусов Цельсия или в течение ночи при комнатной температуре. После высыхания добавьте обычный монтажный материал и накройте секции покровным стеклоподъемником.

Наконец, осмотрите смонтированные срезы под световым микроскопом. Для получения детализированных изображений рекомендуется использовать 100-кратный масляный иммерсивный объектив для расчета коэффициента g. Участки седалищного нерва, погруженные в смоляную среду и окрашенные толуидиновым синим, показали четкие изображения с оптимальным разрешением при увеличении увеличения от 10Х до 20Х, 40Х и 60Х.

Этот метод сохраняет структуру нерва и позволяет получать изображения с высоким разрешением и большим увеличением, что облегчает измерение нескольких параметров, таких как g-отношение, которое представляет собой отношение диаметра аксона, обозначенного стрелкой B, к общему диаметру волокна, обозначенному A. Различные факторы могут привести к менее чем оптимальным участкам периферических нервов, включая наличие трещин в участке из-за неправильного обращения с нервом. Также в разрезе могут возникать отверстия из-за недостаточного обезвоживания. Еще одной возможной ошибкой в процедуре является складывание секций, которую можно исправить с помощью модифицирующих петель для переноса секций на предметное стекло.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как количественная оценка аксонов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какова степень регенерации регенеративного нерва? После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить участки периферических нервов на один-два микрона для оценки морфометрии нерва.