Моделирование синаптических микросхемы с 3D Cocultures астроциты и нейроны от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии о том, как межклеточная коммуникация между несколькими типами нейронных клеток человека способствует формированию и функционированию синаптических цепей. Этот метод быстро и систематически генерирует трехмерные сферы кокультуры функционально зрелых астроцитов и нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Они могут быть использованы для тщательных экспериментальных исследований.

Воспроизводимость и масштабируемость этого протокола является определенной альтернативой новым органоидным технологиям. Они обещают разработку новых лекарств и клеточную терапию для стимулирования нейрорегенерации после травмы или болезни. Начните с установки кластеров HPSC в два миллилитра среды HPSC, содержащей ингибитор рокиназы Y-27632, в каждую лунку шестилуночного планшета с покрытием ECM.

Поддерживайте стволовые клетки до тех пор, пока они не станут примерно на 50% сливающимися, затем замените среду на нейронную, содержащую SB431542 и DMH1, чтобы стимулировать нейронную индукцию. Когда ячейки сливаются примерно на 95%, разделите каждую лунку от одной до шести на новые лунки с покрытием ECM. На 14-й день диссоциируйте ячейки с раствором отслоения и переложите содержимое каждой лунки в колбу Т25 без покрытия со средой, содержащей Y-27632, чтобы способствовать образованию агрегатов.

Чтобы получить предшественников астроцитов и астроцитов в спонтанно сформированных 3D-агрегатах, переключитесь на нейронную среду, содержащую EGF и FGF2, и кормите каждые три-четыре дня до тех пор, пока идентичность астроцитов не будет подтверждена через четыре-шесть месяцев. По умолчанию этот протокол производит дорсальные кортикальные астроциты. Тем не менее, подтипы астроцитов могут быть регионально определены путем добавления морфогенов, образующих узоры, если это необходимо.

Раз в неделю, когда появляются темные центры, собирайте сферы центрифугированием, затем аккуратно диссоциируйте H-астроагрегаты раствором для отслойки. Реплицируйте только те сферы, которые не прикрепляются спонтанно, чтобы избежать пропускания клеток, не относящихся к ЦНС и нервам. После четырех-шести месяцев расширения подтвердите идентичность клетки либо в замораживающей и криоконсервирующей среде в соответствии с инструкциями производителя, либо немедленно используйте для экспериментов.

Для получения нетрансгенных нейронных предшественников в нейронах, или H-нейронов, высевайте нейронные предшественники, полученные из HPSC 14-го дня, в шестилуночные планшеты с покрытием ECM с двумя миллилитрами нервной среды и Y-27632 на лунку. При работе с доксициклин-индуцируемыми iNeurons добавляйте нейронную среду, содержащую доксициклин, когда клетки сливаются примерно на 35%, чтобы вызвать дифференцировку и активировать экспрессию генов. Через два дня подкармливайте трансгенные и нетрансгенные линии двумя миллилитрами нейронных сред на лунку в день.

Продолжайте до тех пор, пока клетки не будут готовы к подъему при 70% конфлюенции. Для кокультур сначала аккуратно диссоциируйте H-астро из 3D-агрегатов с помощью раствора для отсоединения. Затем приступайте к диссоциации H-нейронов, или iNeurons, от 2D-монослоя.

Сначала удалите среду из шестилуночного планшета, и добавьте по 500 микролитров раствора отделения в каждую лунку, содержащую монослойные культуры. Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации аккуратно добавьте два-три миллилитра среды DMEM-F12 для удаления прикрепленных клеток.

Затем соберите клетки в среду в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте при 300-кратном G в течение одной минуты. Отсадите надосадочную жидкость, добавьте один миллилитр свежей среды и аккуратно пипетируйте вверх и вниз с помощью микропипетки объемом 1000 микролитров, чтобы получить одноклеточную суспензию. Подсчитайте каждый тип клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.

Добавьте желаемое соотношение диссоциированных H-astros и H-нейронов, или iNeurons, в общем объеме два миллилитра к каждой лунке микропланшета. Центрифугируйте планшет при 100 умноженных на G в течение трех минут, и верните в инкубатор на двое суток. Через сутки в пластине должны образоваться плотно упакованные микросферы.

С помощью микропипетки объемом 1 000 микролитров аккуратно удалите сферы из микролунок. Слегка приложите усилие к дну микролунок со средой, чтобы удалить любые дополнительные прилипшие сферы. После соберите все сферы в 15-миллилитровую коническую трубку, дайте отстояться.

Затем промойте сферы, сначала отасунув старую среду, а затем добавив не менее двух миллилитров свежей среды. Добавьте шарики в колбу со спиннером, содержащую от 50 до 60 миллилитров среды. Поместите колбу в инкубатор на магнитную мешалку, установленную на 60 об/мин.

Для формирования синапсов необходимо минимум три недели в культуре. Начните с покрытия поверхности каждой многоэлектродной матрицы (MEA) одним миллилитром полиорнитина, чтобы сделать поверхность гидрофильной, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение как минимум четырех часов. После инкубации удалите полиорнитин и промойте поверхность каждого MEA деионизированной водой.

Затем добавьте один миллилитр внеклеточного матрикса, и верните в инкубатор минимум на четыре часа. Когда все будет готово, удалите внеклеточный матрикс, затем нанесите сферы в 1,5 миллилитрах среды на поверхность MEA, убедившись, что сферы расположены поверх электродной матрицы. Дать прилипнуть в течение двух суток.

Чтобы измерить электрическую активность нейронных сфер, поместите MEA на головной стол с регулируемой температурой. Для регистрации спонтанной электрической активности используйте фильтр верхних частот с частотой пять Гц и фильтр нижних частот с частотой 200 Гц, а также порог скачков, равный пятикратному стандартному отклонению. Сохраняйте необработанные данные, включая частоту и амплитуду пиковых нагрузок, для статистического анализа.

Белковые маркеры нервного типа, такие как MAP2 для нейронов и GFAP для астроцитов, визуально демонстрируют равномерно распределенное расположение и зрелость астроцитов в нейронах внутри трехмерных сфер. Максимальная проекция морфологии и ветвления астроцитов показана в репрезентативной 3D-сфере с H-астроми, разреженно помеченными мембранно-связанными GFP. Зрелые H-astros экспрессируют маркеры, включая GFAP.

Несмотря на то, что iNeurons экспрессируют пре- и постсинаптические белки, как показано на изображении слева, синаптическая плотность значительно увеличивается благодаря присутствию H-astros и кокультуре. Во время записи здоровые сферы iNeurons, размещенные на MEA, будут спонтанно вызывать скачки напряжения более 40 микровольт с постоянными частотами срабатывания. Сферы кокультуры демонстрируют большую сетевую связность с присутствием H-astros, что приводит к увеличению синхронных сетевых всплесков спайков.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как визуализация кальция, чтобы измерить физиологическую реакцию астроцитов на синаптическую активность. Кроме того, трансплантация на животных моделях может быть проведена для исследования связи с уже существующими синаптическими цепями. Следуя этому биоинженерному подходу, можно включать внеклеточные биоматериалы и дополнительные типы клеток, такие как олигодендроциты, микроглианы и этиальные клетки, в определенных соотношениях, чтобы смоделировать сложную передачу сигналов, которая происходит в мозге.