Количественные клеточной биологии нейродегенеративные у дрозофилы путем объективного анализа дневно тегами белков с помощью ImageJ

Мы разработали простой и адаптации рабочего процесса для получения количественных данных из ячейки на основе изображений флуоресценции биологических исследований агрегации белков и autophagic потока в центральной нервной системе дрозофилы моделей нейродегенеративные.

Мы разработали этот метод для извлечения количественных данных из исследований на основе флуоресцентной визуализации для извлечения сложных и динамических клеточных биологических процессов в моделях нейродегенерации дрозофил. Основным преимуществом этого метода является его адаптируемый, полуавтоматизированный рабочий процесс анализа изображений, позволяющий свести к минимуму систематическую ошибку выборки, максимизировать мощность выборки и добиться воспроизводимости в полевых условиях. Этот подход может быть расширен для анализа других белковых точек и мембраносвязанных компартментов, участвующих в нейродегенерации, что в конечном итоге улучшит наше механистическое понимание нейродегенеративных заболеваний.

Чтобы сохранить пластинку в целости и сохранности во время вскрытия под стереомикроскопом, проведите два щипца под сетчатку и аккуратно прорвите середину глаза, чтобы удалить сетчатку. Держа щипцы параллельно поверхности пластинки, оттягивайте остатки ткани сетчатки, прикрепленные к пластинке. Препарируйте от трех до пяти мозгов для каждой группы и перенесите мозги в микроцентрифужную пробирку, содержащую соответствующий фиксатор, на 15 минут при комнатной температуре с легким покачиванием.

После трех 15-минутных промываний PBS плюс Triton X-100 или PBTx замените последнее мытье первичным антителом, разведенным в PBTx с 5% нормальной козьей сывороткой для ночной инкубации в аликвотном миксере при четырех градусах Цельсия. На следующее утро удалите избыток антител с помощью трех 15-минутных промываний в PBTx и инкубируйте мозг в соответствующем вторичном антителе, разведенном в PBTx с 5% нормальной козьей сывороткой в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации промойте мозг три раза, как показано на рисунке, и поместите каплю монтажной среды между двумя кусками прозрачной ленты в центре одного предметного стекла для микроскопии каждого образца ткани.

Поместите мозги в монтажный материал на одну-две минуты. Когда ткани станут прозрачными, с помощью пипетки осторожно удалите монтажную среду с каждой стороны. Чтобы получить изображение окрашенных тканей, нанесите каплю свежего монтажного средства на мозг и аккуратно наложите на образцы покровное стекло.

Заклейте края покровного стекла резиновым цементом и просушите стекла на воздухе в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем просмотрите образец на микроскопе и отрегулируйте элементы управления детектором изображения на флуоресцентном микроскопе таким образом, чтобы зафиксировать самое высокое отношение сигнал/шум в самом высоком динамическом диапазоне образца. После оптимизации параметров просмотрите образец из другой группы, чтобы убедиться, что параметры будут подходящими для всего эксперимента.

Затем можно сделать снимок первого образца, сохранив изображение в виде файла, который может сохранить метаданные, такие как параметры сбора данных и пространственная калибровка. Чтобы проанализировать изображения, откройте изображение на Фиджи, выберите «Просмотреть стек с помощью Hyperstack» в диалоговом окне «Параметры импорта биоформатов» и установите цветовой режим «Оттенки серого». Определите область на основе маркерных каналов, которую можно использовать в качестве стандартизированной области интереса для образцов, используя полосу прокрутки C для просмотра каналов и полосу прокрутки Z для перемещения по фокальным плоскостям.

Для упрощения анализа изображения сгенерируйте новое изображение, содержащее каналы и фокальные плоскости, и выберите Изображение и Дублировать. Установите нужные каналы и срезы и измените имя файла, чтобы оно отражало выделение. Вручную выберите стандартизированную область интереса с помощью инструмента «Выбор» на основе ранее определенных критериев выбора.

Нажмите Анализ, Инструменты, Менеджер областей интереса и Добавить, чтобы добавить область интереса в Менеджер областей интереса. Затем нажмите «Еще» и «Сохранить» и присвойте файлу имя, отражающее интересующую его область. Для предварительной обработки изображений нажмите «Обработать» в разделе «Фильтры» и выберите подходящий фильтр.

Здесь выберите настройки фильтра, которые уменьшают шум при сохранении ребер, чтобы облегчить обнаружение интересующих структур во время сегментации. Когда предварительно обработанное изображение активно на Фиджи, нажмите SCF, Маркировка и Интерактивная H_Watershed. На панели управления отрегулируйте динамику затравки, порог интенсивности и пиковое наводнение, чтобы оптимизировать сегментацию.

Когда результаты сегментации будут оптимизированы, выберите «Экспортировать регионы», «Маска» и «Экспорт», чтобы создать двоичное изображение результатов водосбора. Откройте сохраненную стандартизированную область интереса. В Диспетчере областей интереса выберите идентификатор области интереса, чтобы ограничить извлечение объектов стандартизированной областью интереса на изображении.

Когда область интереса активна на маске бинарного водораздела, выберите «Анализ», «Анализ частиц» и «Добавить в менеджер», чтобы извлечь объекты и добавить идентификатор частиц для каждой структуры, очерченной во время сегментации, в Менеджер области интереса. Затем сохраните добавленные частицы, позаботившись о том, чтобы идентификаторы были сняты и все частицы были сохранены в zip-файле. Теперь откройте предварительно обработанное исходное изображение и прокрутите до канала, используемого для съемки интересующих структур.

Откройте частицы, полученные в результате извлечения признаков, и выберите Показать все в Менеджере области интереса, чтобы наложить контур каждой частицы на изображение. Нажмите кнопку Анализ и установка измерений и установите соответствующие экспериментальные измерения. Затем в окне «Менеджер областей интереса» выберите «Измерить», скопируйте и вставьте результаты в соответствующую программу для работы с электронными таблицами для компиляции и дальнейших расчетов.

Количественная оценка количества полуавтоматически сегментированных агрегатов гентингтина RFP из стандартизированных фокальных плоскостей через зрительную долю дрозофилы выявляет диффузную экспрессию непатогенного расширения Гентингтона Q15 в накоплении белковых агрегатов за счет вызывающего заболевание расширения Гентингтона Q138. Профили размера и интенсивности всех агрегатов из стандартизированной фокальной плоскости пяти различных оптических лепестков, экспрессирующих Huntington Q138, иллюстрируют надежность и воспроизводимость этого рабочего процесса. Когда агрегаты переэкспонированы во время получения изображения, количественная оценка размера и количества агрегатов сопоставима с агрегатами, полученными с идеальной экспозицией.

Однако интенсивность переэкспонированных агрегатов становится функцией размера, поскольку насыщенные пиксели демонстрируют максимальное значение интенсивности. Визуализация интенсивности mCherry и GFP в нескольких структурах, связанных с аутофагией, или Atg8-положительных, выявляет различия в репортере, где высокая интенсивность обоих флуорофоров указывает на аутофагосомы. Высокий уровень mCherry и низкий GFP указывает на слияние с лизосомой, поскольку GFP гасится в этом кислотном компартменте.

И, наконец, низкий уровень mCherry отражает деградацию в лизосоме. Диаграмма рассеяния, созданная на основе средней интенсивности флуорофора каждой полуавтоматически сегментированной положительной частицы mCherry Atg8, иллюстрирует поток через лизосомный путь аутофагии, который может быть разделен на дискретные шаги с помощью квадрантного анализа. При выполнении этой процедуры важно помнить, что определяемые пользователем параметры на этапах анализа изображений сильно зависят от приложения.

Поэтому будьте внимательны при документировании рабочего процесса, чтобы обеспечить согласованность и сопоставимость образцов.