Сохранение биологических культур и измерения экспрессии генов в nerii тля: Non модель системы для взаимодействия растений насекомое

Этот метод описывает общие этапы культивирования тли и этапы генетического анализа тли. Эти методы могут быть применены для ответа на ключевые вопросы эволюции и экологии тлей и молекулярных механизмов, лежащих в основе биологии тли. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть применена в целом к большинству видов тли и выполнена при относительно небольших затратах.

Начните с заполнения стандартного лотка для рассады почвой для проращивания смеси для проращивания, следя за тем, чтобы почва достигала верха лунок. Когда все лунки будут заполнены, сделайте в почве каждой лунки отверстие глубиной три сантиметра и поместите в каждую лунку по одному семени. Поливайте клетки до тех пор, пока почва, покрывающая семена, не пропитается и поместите лоток в теплицу с ежедневным или ежедневным поливом, чтобы поддерживать умеренный уровень влажности почвы.

Когда рассада вырастет, ее первый набор полных листьев наполнит четырехдюймовые круглые горшки почвой для горшков, примерно на пять сантиметров ниже их краев. Создайте целую почву достаточно глубоко, чтобы она доходила до дна горшка, и аккуратно зачерпните зрелые саженцы вручную, чтобы поместить их глубоко в отверстия в новых горшках. Затем засыпьте рассаду почвой и поливайте рассаду ежедневно или через день, чтобы поддерживать умеренный уровень влажности почвы.

Когда растения вырастут по крайней мере на три-четыре комплекта полных листьев и достигнут высоты не менее десяти сантиметров, вручную осмотрите растения на наличие нежелательных вредителей и с помощью ротовой пипетки осторожно перенесите одну размножающуюся полевую взрослую тлю на лист первого растения, чтобы создать изоклональную линию. Когда вся тля будет перенесена, надежно накройте растения изготовленной на заказ чашечной клеткой и поместите зараженные тлей растения в камеру с контролируемой средой. Чтобы поддерживать популяцию запаса, используйте ротовую пипетку, чтобы безопасно еженедельно пересаживать от одной до трех нимф второго или третьего возраста и одну взрослую старую тлю на новое растение.

И накройте каждое растение новой чашкой-клеткой для культуры, как показано на рисунке. Для извлечения ДНК из одной взрослой тли поместите тлю на дно стерильной микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 миллилитров, содержащей жидкий азот, и измельчите тлю пестиком. Далее добавьте в микроцентрифужную пробирку 100 микролитров буфера для лизиса и продолжайте измельчать измельченную тлю до тех пор, пока образец не станет заметно распадающимся.

Промойте пестик дополнительными 100 микролитрами буфера для лизиса, и выдержите наземную тлю при температуре 65 градусов Цельсия в течение 30 минут. В конце инкубации добавьте в пробирку 14 микролитров эмулора ацетата калия и переверните для перемешивания. Через 30 минут на льду соберите клеточный мусор центрифугированием и переложите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, не потревожив гранулу.

Добавьте 200 микролитров холодного 100-процентного молекулярного этанола в надосадочную жидкость и переверните пробирку для перемешивания. Через 15 минут при комнатной температуре соберите осажденную ДНК центрифугированием, а этанол удалите пипеткой. Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах холодного 70-процентного молекулярного этанола с перелистыванием для второй промывки центрифугой.

И ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах свежего, холодного 100-процентного молекулярного этанола. После третьего центрифугирования поместите пробирку горизонтально на лист папиросной бумаги для сушки на воздухе в течение пяти-десяти минут. И ресуспендировать гранулу ДНК в 80 микролитрах low tris edta.

Затем количественно оцените ресуспендированную ДНК в спектрофотометре и сохраните оставшийся образец при температуре четыре градуса Цельсия. После измельчения до пяти взрослых особей тли в жидком азоте, как показано на рисунке, перенесите образец в вытяжной шкаф и добавьте в пробирку с образцом 800 микролитров реагента для экстракции тиоцианат-фенол-хлороформа гуанидиния. Гомогенизируйте образец с помощью пестика и инкубируйте гомогенат в течение пяти минут при комнатной температуре.

Далее добавьте в пробу 160 микролитров хлороформа, после чего в течение 15 секунд энергично встряхивайте рукой. Затем инкубируйте образец в течение двух-трех минут при комнатной температуре и центрифугируйте для сбора извлеченной РНК. Чтобы осаждать РНК, перенесите водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку без РНС, не нарушая промежуточную фазу, и добавьте в РНК 400 микролитров изопропанола.

После десятиминутной инкубации при температуре минус 20 градусов Цельсия соберите осажденную РНК методом центрифугирования. Затем промойте образец два раза одним миллилитром 75-процентного этанола в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом, до образца с помощью медленного вортексирования и центрифугирования для удаления любых фенольных загрязнителей. После второй промывки, в основном, высушите гранулу на воздухе в течение пяти-десяти минут на стерильном столе и растворите РНК-гранулу в 30 микролитрах ультрачистой воды с помощью щадящего пипетирования перед десяти-15-минутной инкубацией при температуре от 55 до 60 градусов Цельсия.

Семенам потребуется примерно от двух до четырех недель, в зависимости от сезона, чтобы вырасти достаточно большими, чтобы их можно было пересадить. Пересаженной рассаде потребуется еще две-четыре недели, чтобы вырасти до оптимального размера для культуры тли. Взрослые особи aye-near-ee-eye отличаются затемненным хвостом и могут быть некрылатыми или крылатыми.

Развивающиеся подушечки крыльев становятся заметными, когда нимфы достигают третьего возраста. Один взрослый человек будет давать примерно от 100 до 200 нанограммов на микролитр ДНК и от 150 до 300 нанограммов на микролитр РНК. Затем можно рассчитать относительную экспрессию гена-кандидата при различных условиях лечения.

При попытке выполнить эту процедуру важно не загрязнить свои изоклональные запасы. Кроме того, помните, что качество тли сильно зависит от качества ваших растений. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы экстракции и секвенирования, чтобы ответить на вопрос о молекулярных механизмах, лежащих в основе биологии тли.