Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Здесь мы представляем протокол точно определить несколько генетические изменения целевого региона в одном реакции с использованием высадки ddPCR и уникальный Пара зондов гидролиза.

Этот метод может быть использован в качестве диагностического инструмента для рака для анализа циркулирующих ДНК опухоли. Этот метод вызывает многочисленные генетические изменения в регионах кластерных мутаций в одной реакции. Это помогает сохранить драгоценные образцы пациента.

Этот метод может дать представление о нагрузке опухоли на ее мутационный профиль. Теперь он также может быть применен к молекулярному анализу в качестве альтернативы qPCR для получения абсолютной количественной оценки последовательности целевых нуклеиновой кислоты. Соберите образцы крови в семими миллилитровых трубках ЭДТА.

Две трубки рекомендуется собрать около четырех миллилитров плазмы. Центрифуга образцов крови в течение 10 минут в 820 раз тяжести в течение трех часов после притяжения крови, чтобы отделить красные кровяные тельца, белые кровяные тельца и плазмы. Время между отбором проб и центрифугированием имеет решающее значение для получения высококачественной Т-клеточной ДНК, не загрязненной ДНК, высасывленной из белых кровяных телец.

После центрифугации используйте серологическую пипетку для сбора супернатанта, не касаясь слоя белых кровяных телец. Около двух миллилитров плазмы, как правило, восстанавливаются на EDTA трубки. После переноса плазмы в две миллилитровые трубки, центрифуга алициты при 16000 раз тяжести в течение 10 минут при 15 градусах по Цельсию, чтобы удалить клеточный мусор.

Тщательно соберите плазму, не нарушая гранулы и перенесите на две миллилитровые криогенные трубки. Хранить при отрицательном 80 градусов по Цельсию до необходимости. Начните с добавления 400 микролитров протеиназы K в 50-миллилитровую трубку.

Затем добавьте четыре миллилитров плазмы и 3,2 миллилитров буфера лиза ACL, содержащего один микрограмм несущей РНК из комплекта экстракции. Закройте трубку и перемешайте вихрем в течение 30 секунд, чтобы получить однородный раствор. Затем инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 30 минут.

После инкубации добавьте 7,2 миллилитров буферного ACB в лизат для оптимизации связывания циркулирующих нуклеиновых кислот с кремнеземной мембраной. Смешайте вихрем в течение 15 до 30 секунд. Затем инкубировать трубку на льду в течение пяти минут.

Прикрепите колонку и 20 миллилитровый удлинитель на вакуумный насос. Закройте неиспользованные части, чтобы вакуумное стремление. После краткого центрифугирования трубки, осторожно ввести смесь в трубку удлинитель.

Затем включите вакуумный насос и позвольте лисировать быть обращено через столбцы полностью. Удалите и отбросьте расширитетель трубки. Затем примените к столбец 600 микролитров буфера ACW1.

Когда буфер ACW1 протянут через столбец, добавьте 750 микролитров буфера ACW2 и, наконец, 750 микролитров от 96 до 100% этанола. Затем поместите столбец в чистую двухмилилитровую трубку сбора и центрифугу на полной скорости в течение трех минут, чтобы устранить этанол. После размещения колонки в новую двухми миллилитровую трубку сбора, откройте крышку, а затем инкубировать при 56 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы полностью высушить мембрану.

После инкубации поместите столбец в чистую 1,5 миллилитровую низкосвязательную трубку. Аккуратно нанесите 36 микролитров воды без RNase с 0,04% азида натрия. Затем закройте крышку и инкубировать при комнатной температуре в течение трех минут.

Центрифуга на полной скорости снова в течение одной минуты, чтобы elute нуклеиновых кислот. Затем, хранить при отрицательном 20 градусов по Цельсию, пока это необходимо. Начните с оттаивания и эквилибации компонентов реакции к комнатной температуре в чистом вытяжке ПЦР.

Затем приготовьте 20-х раз смесь грунтовки и зондов в RNase и Dnase свободной дистиллированной воды с каждой грунтовки на 18 микромолящих концентрации и каждый зонд в пяти микромоляных концентрации. Для всех отдельных реакций ПЦР подготовьйте смесь образца, объединив 10 микролитров в два раза ddPCR Supermix, один микролитр 20 раз грунтовки и зонды смеси, и до 10 нанограммов образца ДНК в 20 микролитров дистиллированной воды. Vortex реакционной смеси тщательно, чтобы обеспечить однородность.

И кратко центрифуги для сбора содержимого в нижней части трубки перед дозированием. Вставьте картридж ddPCR в держатель и загрузите 20 микролитров смеси реакции образца в средние скважины картриджа для производства капель. Добавьте 70 микролитров масла генератора капель в нижние скважины.

Вставьте картридж с прокладкой в генератор капель. Капли будут производиться в верхних скважинах картриджа. Медленно и осторожно аспирировать 40 микролитров капель из картриджей и обойтись в 96-хорошо ПЦР пластины.

Печать окончательной пластины ПЦР с алюминиевой фольгой с помощью герметителя пластины сразу после передачи капель, чтобы избежать испарения. Кратко центрифуга пластины для сбора содержимого на дне скважин. Запустите обычное усиление ПЦР на тепловом циклере.

Когда пробег будет завершен, кратко центрифуга пластины для сбора содержимого на дне скважин. После усиления ПЦР используйте считыватель капель для подсчета положительных ПЦР и отрицательных капель ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Ниже приведены репрезентативные результаты, полученные в ходе оптимизации анализа DdPCR.

На этом снимке показано обнаружение ДНК мутантов и ДНК дикого типа в реакции, содержащей 100%мутантную ДНК, 5%мутантную ДНК и 100% ДНК дикого типа. На этом снимке показаны примеры образцов плазмы, проанализированных с помощью анализов KRAS и EGFR, показывающих обнаружение одного нуклеотида и множественные замены в экзоне два KRAS и удаление в EGFR exon 19. При попытке этой процедуры, важно действовать осторожно на каждом шагу с особым вниманием на поколение капель, что является критическим шагом этого метода.

После своего развития, этот метод проложил путь для исследователя и клинициста в области исследований рака для оптимизации анализа мутации опухоли с помощью жидкой биопсии.