Идентификация Морская минога феромоны, используя Bioassay руководствуясь фракционирования

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химической экологии, такие как идентификация феромонов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он связывает новые соединения с функцией феромонов. Чтобы начать эту процедуру, поместите 15-30 половозрелых самцов морских миног в резервуар, снабженный 250 литрами газированной воды озера Гурон, поддерживаемой при температуре 16-18 градусов по Цельсию.

Чтобы извлечь кондиционированную воду методом твердофазной экстракции, необходимо пропустить ее из резервуара через насосную систему в верхнюю часть колонны. Вода проходит через слой из двух килограммов умеренно полярной, полимерной ионообменной смолы, содержащейся в серии из четырех стеклянных колонн емкостью один литр. Затем удалите органический растворитель и соберите экстракт путем ротационного выпаривания в течение пяти часов при пониженном давлении при 40 градусах Цельсия.

Чтобы изолировать бассейны фракций, замочите силикагель в начальной подвижной фазе на 30 минут. Перенесите гель с растворителем в стеклянную колонну и откройте ее клапан, чтобы позволить подвижной фазе пройти. Далее тщательно перемешайте экстракты с силикагелем и загрузите их в колонку жидкостной хроматографии над слоем силикагеля.

Разбавьте их градиентом от 95% хлороформа до метанола до 100% метанола, в результате чего получится в общей сложности 2,5 литра, затем соберите элюент в отдельные 10-миллилитровые флаконы. Затем проведите эксперимент TLC на предварительно покрытых силикагелевых пластинах, нанеся образец на стартовую линию и погрузив начальную линию пластины в проявляющийся растворитель в герметичном стеклянном резервуаре. После того, как проявляющийся растворитель достигнет конечной линии, выньте пластину из бака и подождите 10 минут, пока растворитель испарится.

Визуализируйте пятна сначала под воздействием ультрафиолетового излучения с яркостью 254 нанометра, затем окрасьте пластину, распылив на нее кислотный раствор метанола с содержанием 5% анисальдегида с помощью хроматографического распылителя и нагрев его до 85 градусов Цельсия в течение трех минут. После этого концентрируйте фракцию до остатка путем ротационного выпаривания при пониженном давлении при 40 градусах Цельсия в течение примерно 30 минут. Для регистрации ЭОГ необходимо с помощью микропипетки заполнить полированные капиллярные электроды и твердотельные держатели электродов, предварительно изготовленные из гранул хлорида серебра

Затем вставьте поляризованные электроды в держатели электродов. Далее приготовьте 100 мл 10 до минус пяти моляров L-аргинина в отфильтрованной древесным углем воде от 10 до минус двух моляров L-аргинина в деионизированной воде в мерной колбе. Для кривой реакции концентрации приготовьте 10 миллилитров 10-кратных разведений пулов фракций.

Теперь сориентируйте миногу под наркозом на V-образную подставку и оберните ее влажным бумажным полотенцем, чтобы предотвратить высыхание. Введите в щечную полость трубку с рециркуляционной, аэрированной водой, содержащей 50 миллиграммов на литр MS222. Отрегулируйте расход и убедитесь, что вода выходит через жаберные отверстия для непрерывного орошения жабр.

Промойте трубку подачи одоранта фильтрованной водой и подсоедините ее к клапану, установленному на микроманипуляторе. Затем поместите капиллярную трубку для подачи одоранта в полость обонятельного эпителия, чтобы отфильтрованная вода подавалась в обонятельный эпителий, чтобы предотвратить высыхание при отсутствии введения одорантов. Затем установите записывающий электрод и электрод сравнения на микроманипуляторы.

Опустите электрод сравнения на внешнюю кожу возле ноздрей. С помощью стереоскопического микроскопа опустите записывающий электрод так, чтобы едва касаться поверхности обонятельного эпителия. Затем перенесите поглощение трубки подачи одоранта с фоновой фильтрованной воды на 10-10 в минус пятимолярный раствор L-аргинина.

Включите компьютер, усилитель, фильтр и дигитайзер. Используя программное обеспечение драйвера клапана, запрограммируйте процедуру подачи четырехсекундного одиночного импульса одоранта, установив флажок T1, установив T на четыре секунды и установив флажок T2.In программного обеспечения для сбора данных, установите режим сбора данных на высокоскоростной осциллограф. Нажмите значок воспроизведения, а затем нажмите кнопку «Пуск» в драйвере клапана, чтобы запустить импульс одоранта.

Начните записывать пустой контроль, L-аргинин, а затем одоранты от низких до высоких концентраций с двухминутной промывки фильтрованной воды между применениями. Чтобы выявить поведенчески активные фракции, акклиматизируйте половозрелую самку морской миноги в клетке для выпуска в лабиринте в течение пяти минут. Отпустите морскую миногу и запишите суммарное количество времени, которое минога проводит в опытном и контрольном каналах, каждый из которых содержит речную воду, в течение 10 минут.

Затем подайте тестовый стимул на случайно назначенный экспериментальный канал в транспортном средстве на контрольный канал с помощью перистальтических насосов с постоянной скоростью 200 миллилитров в минуту в течение пяти минут, затем примените тестовый стимул в транспортном средстве еще на 10 минут и запишите совокупное количество времени, которое минога проводит в экспериментальном и контрольном каналах. В этой процедуре проводят дальнейшую очистку активных фракций до соединений с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки sephadex LH-20. Подготовьте образец в 0,5 миллилитрах начальной подвижной фазы, загрузив его в колонну хлороформа-метанола, а затем в колонну метанола, и разбавьте активные фракции до получения соединения.

Растворите и разбавьте очищенное соединение в начальной подвижной фазе ВЭЖХ с образованием 10-микролитрового раствора с концентрацией примерно один микрограмм на миллилитр. Далее переложите раствор образца во флаконы с ВЭЖХ и установите их в автопробоотборник ВЭЖХ. Введите образец в масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением и запишите спектры ионизационной масс-спектрометрии с высоким разрешением с помощью хроматографического масс-спектрометра.

Полностью растворите образец в выбранных дейтерированных растворителях с образованием раствора с концентрацией примерно от 0,1 до 10 миллиграммов на миллилитр. Перенесите раствор образца в ЯМР-трубку для записи 1D и 2D спектров ЯМР на ЯМР-спектрометре с частотой 900 МГц. Здесь показан ЯМР-спектрометр с частотой 600 мегагерц.

Были идентифицированы пять новых предполагаемых феромонов морских миног, структура которых была выяснена с помощью спектрометрических и спектроскопических методов. Эти предполагаемые феромоны стимулировали обонятельный эпителий взрослой морской миноги и имели низкие пороги обнаружения в электроольфактограммах. В поведенческих анализах лабиринта с двумя вариантами выбора овулированные самки морских миног привлекались к петромизону А, петромизена А и петромизена В и отталкивались от петромизона С. Пытаясь выполнить эту междисциплинарную процедуру, важно помнить о необходимости координации химических и биологических экспериментов для выполнения этого итеративного протокола.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как рентгеновская кристаллография и реакции дериватизации, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как стереохимия соединений. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области природных продуктов и нейроэтологии для изучения вероятного биосинтеза и биологической функции феромонов в водных организмах, таких как морская минога. Не забывайте, что работа с хлороформом может быть чрезвычайно опасной, и при работе с этим реагентом всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в химическом капюшоне, ношение перчаток и защитных очков.