Роговицы эпителиальных истиранию с глазной заусенцев, как модель для роговицы заживление ран

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с клеточными и молекулярными механизмами, участвующими в заживлении раны роговицы. Преимущество этой методики заключается в том, что она отражает ситуации в отделении неотложной помощи в случае вставки роговицы, то есть ссадины или царапины на поверхности глаза. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я изучал клетки-предшественники эпителия роговицы и их поведение в ситуации, которая ставит под угрозу гомеостатическое поддержание роговицы.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что выполнение абразии роговицы является сложным делом и требует практики. Сначала приготовьте 0,1%-ный раствор флорецина для визуализации истирания под действием кобальтового синего света, отмерив 10 миллиграммов флорециновой соли тонкой шкалой. Затем добавьте соль в 10 миллилитров буферного солевого раствора Фосфата.

Защитите раствор Флорецина от света и встряхивайте в течение пяти минут. Стерильно отфильтруйте раствор во флакон с пипеткой, и бейте от света. Раствор Флорецина можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух-трех дней.

Очистите наконечник глазного заусенца до и после использования. Сначала с PBS, а затем с 70% этанолом. Начните с того, что положите мышь под наркозом на бумажное полотенце на нагревательную тарелку, нагретую до 37 градусов по Цельсию.

Проверьте уровень анестезии, введя щипок хвостом и щипки пальцев ног. Уровень анестезии хороший, если хвостовой рефлекс отсутствует, но присутствует пальцовый рефлекс. Поверните основание жернова, чтобы включить вибрацию.

Откройте глаз, который нужно стереть, раздвинув веки пальцами. Затем плотно прикоснитесь заусенцем к роговице и перемещайте инструмент вперед-назад и вбок по поверхности глаза, не поднимая заусенец. Вибрация заусенцев выполнит царапины.

Не надавливайте, не трясите и не рвите роговицу. В центральной части роговицы достаточно 20 истирающих движений по поверхности, чтобы вызвать рану. Сделать абразию роговицы сложно и требует практики.

Обязательно обратите внимание на правильное нажатие, и постарайтесь выполнить абразивную обработку всего за одну попытку. Нанесите одну каплю раствора флуорецина на стертый глаз из флакона-капельницы. Затем промойте глаз один раз 0,9%-процентным физиологическим раствором, чтобы уменьшить фон флорецина.

Впитайте лишнюю жидкость мягкой салфеткой и при необходимости очистите ресницы. Чтобы изобразить истирание, расположите настольную лампу с прикрепленной кобальтово-синей ручкой прямо над глазом мыши. Кнопка фонаря пера может быть прикреплена скотчем, чтобы свет оставался включенным при работе в одиночку.

Наведите зеркальную камеру на глаз при комнатном освещении, затем выключите все остальные источники света, кроме кобальтово-синего ручного света. При освещении кобальтово-синим светом стертая область флуоресцирует зеленым цветом из-за молекул флоресина, захваченных в неровной поверхности. Используйте зеркальную камеру, чтобы сделать снимки глаза.

После визуализации глаза верните мышь на подогретую пластину. Нанесите каплю антибактериальной глазной мази Фуцидин в глаза как на стертые, так и на нестираемые глаза, чтобы увлажнить и сохранить поверхность глаза чистой от бактерий после анестезии. Наблюдайте за мышью на нагретой пластине в течение пяти-20 минут, после анестезии, периода пробуждения.

Когда мышь станет подвижной, поместите ее в чистую клетку. После усыпления животного утвержденным методом соберите глазное яблоко, предварительно разрезав и вскрыв в коже сбоку глаза ножницами для вскрытия. Затем поместите ножницы под глазное яблоко и разрежьте глазной нерв, чтобы выкачать глазное яблоко из орбиты.

Поместите глаз в миску, содержащую PBS. Используйте иглу 26 калибра, чтобы сделать отверстие на задней части глаза со стороны сетчатки, чтобы обеспечить свободное проникновение растворов внутрь глаза. Перенесите глаз в двухмиллилитровую трубку, содержащую PBS.

Затем удалите PBS, добавьте четыре процента параформальдегида и зафиксируйте глаз при температуре четыре градуса Цельсия на четыре-пять часов. На этом изображении показан глаз мыши сразу после истирания. Сигнал Florecine помечает стертую область ярко-зеленым цветом, в то время как все остальные участки эпителия остаются темными.

Пунктирной линией обозначены границы раны. На изображении показан неповрежденный двусторонний глаз, который служит контролем. Белое пятно – это отражение от камеры.

Через 18 часов после ссадины эпителий роговицы в значительной степени закрывается над обнаженной областью, остается лишь небольшая ссадина. Через 72 часа после истирания зеленый сигнал не виден. Это указывает на то, что эпителий роговицы был полностью реэпителизирован через 72 часа после абдинии.

Абразия сосредоточена на эпителии роговицы, показанном здесь в неповрежденном глазу, поэтому более глубокие слои роговицы остались неповрежденными. Сразу после истирания окрашивание H и E обнажает край ссадины, обозначенный этим астериксом как узкий а-клеточный выступ, который непрерывен из правильного слоя роговицы толщиной от четырех до пяти клеток. Через 18 часов после травмы процесс заживления активен, и продолжается повторная эпителизация.

Об этом свидетельствует появление переднего края из одного-двух слоев эпителиальных клеток, который покрывает обнаженную область. Поверхность выглядит полностью реэпителизированной к 72 часам, так как мигрирующие фронты покрывают рану, и все эпителиальные слои снова присутствуют. После освоения эта техника может быть выполнена за два часа, если она правильно выполнена двумя исследователями.

Планируя и пробуя эту процедуру, важно помнить о необходимости следовать местным рекомендациям по благополучию животных и поддерживать хорошую и стерильную лабораторную практику. Следуя этому протоколу, могут быть выполнены другие методы, такие как трассировка Линиса, чтобы ответить на дополнительные вопросы о заживлении ран роговицы, реэпителизации и восстановлении тканевого гомеостаза в роговице.