Спектрофотометрические определение содержания Phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis

Общей целью данного протокола является количественное определение содержания фикобилипротеинов в модельной цианобактерии Synechocystis с помощью спектрофотометрического метода. Фикобилипротеины представляют собой водорастворимые пигментно-белковые комплексы, которые представляют собой основные компоненты светособирающих антенн у прокариотических цианобактерий и нескольких групп эукариотических водорослей. Поскольку фикобилипротеины являются основными светособирающими комплексами, они представляют собой один из важнейших факторов, определяющих продуктивность водорослей и цианобактерий.

Synechocystis – это модельная цианобактерия, которая используется в сотнях лабораторий по всему миру. Synechocystis содержит два фикобилипротеина, фикоцианин и аллофикоцианин. Этот протокол описывает простой, эффективный и надежный метод количественного определения обоих фикобилипротеинов в данном штамме плесневых грибов.

Мы сравнили несколько методов: экстракцию фикобилипротеинов и спектрофотометрическое количественное определение. Метод количественной оценки должен быть протестирован для каждого отдельного штамма, поскольку спектры поглощения фикобилипротеинов могут варьироваться в зависимости от штамма. В начале экстракции фикобилипротеинов переложите один миллилитр культуры цианобактерий в пробирку с безопасным замком.

Если вы решили определить сухую массу образцов, проведите массу пустых пробирок перед забором культуры. Следите за тем, чтобы культура не оседала. Центрифугируйте клетки при 15 000 G при лабораторной температуре в течение пяти минут.

Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Обязательно не тревожьте гранулы. Поместите образцы в морозильную камеру.

Для длительного хранения держите образцы при температуре 80 градусов Цельсия. Это необходимо для предотвращения деградации фикобилипротеинов. После того, как образцы будут заморожены, вставьте их в сублимационную сушилку.

После начала сублимационной сушки проверьте температуру и давление в сублимационной сушилке. Температура должна быть ниже 60 градусов по Цельсию, а давление должно быть около одного гектара Паскаля. Сублимационная сушка образцов в течение ночи.

После завершения цикла сублимационной сушки как можно скорее закройте трубки, чтобы предотвратить повторное поглощение воды из воздуха. Добавьте четыре шт по две миллилитровые стеклянные бусины в каждую пробирку с образцом. Гомогенизируйте образцы стеклянными шариками в течение 15 секунд.

Правильно гомогенизированный образец распределяется по всей внутренней поверхности пробирок с безопасным замком. После гомогенизации клеток добавьте в образцы один миллилитр фосфатно-солевого буфера для извлечения фикобилипротеинов. Оптимальный pH PBS составляет около 7,4.

Перемешайте клетки с PBS в течение пяти секунд на гомогенизаторе. Это обеспечит оптимальное смешивание образцов для эффективной экстракции фикобилипротеинов. После смешивания образцы получаются зеленоватыми.

Держите образцы на льду в течение 60 минут для наиболее эффективного извлечения фикобилипротеинов. После экстракции образцы центрифугируют при температуре 15 000 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После центрифугирования надосадочная жидкость приобретает голубой цвет.

Перед спектрофотометрическим измерением откалибруйте спектрофотометр с помощью PBS в качестве заготовки. После калибровки спектрофотометра отбраковывается PBS из одного спектрофотометра кювета и пипетка выводится надосадочная жидкость с экстрагированными фикобилипротеинами вместо отброшенного буфера. Для количественного определения фикоцианина и аллофикоцианина надосадочная жидкость с экстрагированными фикобилипротеинами измеряется на 615, 652 и 720 нанометрах.

Как описано в тексте, в литературе известно несколько уравнений для количественного определения фикобилисом. Уравнение, используемое в этом протоколе, оказалось наилучшим коррелирующим между концентрациями фикоцианина и аллофикоцианина в качестве пигментов и точек. Важнейшими этапами протокола являются гомогенизация и экстракция клеток, которые должны обеспечить как высокую продуктивность, так и высокую специфичность.

Мы протестировали несколько процедур экстракции, таких как разрушение клеток с помощью ультразвука, гомогенизация с помощью гранул диоксида циркония или замораживание клеточного соединения. Метод по этому протоколу обеспечивал наибольший выход фикобилисом. Поскольку даже небольшое загрязнение белкового экстракта хлорофиллом может привести к завышению содержания фикобилипротеинов, необходимо избегать любой экстракции хлорофилла из клеток.

Мы обнаружили хлорофилл в сыром экстракте, а затем использовали ультразвук для разрушения клеток. При повторении циклов ультразвуковой обработки концентрация хлорофилла увеличивалась. Время гомогенизации было оптимизировано до 15 секунд.

Гомогенизация в течение пяти и 20 секунд давала несколько меньший урожай. Добавление хлорида натрия или калия в буфер PBS или в воду не повышало эффективность экстракции фикобилипротеинов, как это было в буфере из ацетата натрия. Время экстракции фикобилипротеинов было оптимизировано на 60 минут, так как через 120 и даже 240 минут концентрация фикобилипротеинов существенно не изменилась.

Убедитесь, что поглощение на 615, 652 и 720 нанометрах соответствует ближнему диапазону поглощения спектрофотометра. Спектрофотометр, используемый в этом протоколе, показывает ближний диапазон поглощения от 0,1 до трех. Мы сравнили несколько уравнений спектрофотометрической количественной оценки фикобилипротеинов, известных из литературы.

Уравнение Беннетта и Богорада обеспечило наилучшую реконструкцию содержания фикоцианина и аллофикоцианина в стандартах пигментов с известными концентрациями белка. Различия между отдельными уравнениями связаны с вариациями коэффициентов угасания фикобилипротеинов конкретного организма. Применение стрептомицина сульфата не приводило к снижению хлорофилла А в образцах, где применялась ультразвук или избегалась.

В качестве репрезентативных данных мы определили содержание фикобилипротеинов в клетках Synechocystis. Содержание фикобилипротеинов снижалось при увеличении освещенности. Протокол был разработан для минимизации затрат времени и оборудования на письменный анализ пигмента, который может быть выполнен в любой стандартной лаборатории.

Кроме того, протокол содержит еще два этапа, таких как сублимационная сушка клеточной гранулы и экстракция белков. Общее трудозатраты на количественное определение фикобилисом составляют не более двух часов.