Динамический протеомных и Мирна анализ Polysomes от изолированных мыши сердца после Langendorff перфузии

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о динамическом синтезе белка и протеоме, участвующем в этом процессе. Этот метод позволяет идентифицировать мРНК, которые отбираются для трансляции, микроРНК, которые могут участвовать в процессе и мешать трансляции, а также белки, которые участвуют в трансляции белка или сами транслируются. Этот метод может дать представление о сердечных реакциях на стресс, но также может быть применен для изучения острых реакций на стресс в других органах.

Демонстрировать процедуру будет Мирослава Штястна, научный сотрудник проекта из лаборатории Дженнифер Ван Эйк. В день эксперимента заполните левый отсек градиентного миксера пятью миллилитрами 15% раствора градиента сахарозы, а правый отсек — пятью миллилитрами 50% раствора градиента сахарозы. Откройте кран и включите насос, чтобы перемешать два небольших отсека с помощью магнитной мешалки, и используйте трубку, соединенную со вторым краном, чтобы смешанные растворы сахарозы стекали в одну ультрацентрифужную пробирку с тонкими стенками на льду.

Затем гомогенизируйте свежую или замороженную сердечную ткань с помощью POLYTRON в фильтрованном буфере для лизиса в течение 15 секунд на льду. В конце инкубации центрифугируйте лизат, чтобы удалить нерастворимый материал, и соберите надосадочную жидкость. Отложите 50 микролитров надосадочной жидкости для определения белка, выделения РНК и анализа целостности РНК, а также нанесите слой от 100 до 500 микролитров оставшейся надосадочной жидкости поверх градиентного раствора.

Используйте свежий буфер для лизиса, чтобы сбалансировать объемы между двумя градиентными пробирками, и ультрацентрифугируйте образцы в ультрацентрифуге с качающимся ротором ведра. Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить градиент сахарозы до или после центрифугирования. Для сбора градиентов запрограммируйте сборщик фракций на отбрасывание первых трех минут сбора и сбор тяжелых, легких и нетранслируемых фракций со скоростью один миллилитр в минуту в 17 фракциях от четырех до 19 минут с непрерывным контролем поглощения на 254 нанометрах.

Положите каждую фракцию на лед, как только она будет собрана. Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию, если они не обрабатываются сразу. Чтобы извлечь белки из полисомных фракций, объедините собранные фракции сахарозы в три конечные фракции и пометьте фракции как тяжелые, легкие и нетрансляционные.

Смешайте 0,5 миллилитра каждого образца с 60 микролитрами 100% трихлоруксусной кислоты или ТСА. Инкубируйте фракции в течение ночи при температуре минус 20 градусов Цельсия в темноте. На следующее утро разморозьте образцы на льду перед гранулированием белков методом центрифугирования.

Выбросьте надосадочную жидкость, а гранулы промойте два раза по 0,5 миллилитра охлажденного ацетона минус 20 градусов Цельсия на центрифугирование. Убедитесь, что гранулы после осаждения ТСА полностью растворились, используя импульсную ультразвук для обеспечения полной солюбилизации, если это необходимо. Высушите гранулы на воздухе после последней промывки перед ресуспензией в 360 микролитрах буфера Tris-HCl.

Затем добавьте 40 микролитров дитиотреитола для 45-минутной инкубации при температуре 55 градусов Цельсия с встряхиванием. В конце инкубации добавьте 50 микролитров йодоацетамида в образцы для 30-минутной инкубации в шейкере при комнатной температуре, защищенной от света, с последующим расщеплением образцов с соотношением трипсина к весу от массы тела до белка 1 к 50 для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия. На следующее утро, после охлаждения, кратко центрифугируйте образцы и отрегулируйте pH до двух-трех с 10% муравьиной кислотой, чтобы погасить активность трипсина.

Для обессоливания образцов сначала кондиционируют сорбент в лунках 96-луночного планшета с 200 микролитрами метанола три раза, а затем трижды кондиционируют 200 микролитрами 0,1%-ной муравьиной кислоты на лунку. Затем загрузите образцы в каждую лунку и промойте образцы три раза 200 микролитрами 0,1% муравьиной кислоты на промывку. Используя гравитацию с последующим низким вакуумом, вымывайте образцы со 100 микролитрами 0,1% муравьиной кислоты в 50% ацетонитрила два раза в одну пробирку с низким удержанием белка 0,5 мл на образец.

Затем используйте концентратор для выпаривания образца, элюируемого до сухого состояния, и восстановите каждую гранулу триптического пептида в объеме от 50 до 100 микролитров 0,1% муравьиной кислоты для масс-спектрометрического анализа. Анализ мРНК может быть выполнен для оценки распределения конкретной мРНК, представляющей интерес, в каждой фракции или для количественной оценки и сравнения комбинированных полирибосомных трансляционных фракций с нетранслирующей фракцией в виде отношения содержания мРНК в каждой фракции. Например, здесь показаны изменения в распределении мРНК между трансляционными и нетрансляционными фракциями после ишемии или реперфузии ишемического сердца мыши по сравнению с фиктивным лечением сердца.

В этом репрезентативном эксперименте анализ подмножества микроРНК в объединенных тяжелых фракциях показал, что 22 микроРНК были связаны с полисомами во время ишемии, девять — во время ишемии и реперфузии, а семь — общими для обоих состояний, демонстрируя, что ассоциация микроРНК является динамической в ответ на стрессы ишемии и реперфузии. Кроме того, большинство митохондриальных рибосомных белков были идентифицированы в легкой фракции, а большинство цитозольных рибосомальных белков были идентифицированы как в тяжелой, так и в легкой фракции. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нужно быть очень осторожным с градиентом сахарозы.

Осадок ТСА для экстракции белков из полисомных фракций был выбран в нашей технологической схеме на основании как возможности обработки фракции с высокой концентрацией сахарозы, так и количества белков, идентифицированных с помощью масс-спектрометрии. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности из-за проблем, связанных с воспроизводимостью градиента сахарозы. Осаждение ТСА является преимуществом, так как для осаждения белков необходимы лишь небольшие объемы, гранула видна на дне трубки, а сахарозы при осаждении не накапливается.