Визуализация генетических вариантов, короткие цели и точечные мутации в контексте морфологических ткани с РНК в Situ гибридизация Assay

Этот метод может решить ключевые исследовательские вопросы в нейробиологии, онкологии и за ее пределами, такие как специфическая экспрессия типов клеток и пространственное картирование сплайс-вариантов в мозге и опухолевом микроокружении. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может обнаруживать экзонные соединения, короткие последовательности и точечные мутации в тканевом контексте с очень высокой чувствительностью и специфичностью в отдельных клетках. Демонстрировать процедуру будет Хелл Пиментель, младший научный сотрудник нашей лаборатории.

Чтобы подготовить ткань, немедленно после рассечения зафиксируйте ее в 10% нейтральном буферизованном формалине при комнатной температуре от 16 до 32 часов. Впоследствии образец обрабатывают и погружают в парафин с помощью стандартных процедур. Разрежьте заложенную ткань на пять плюс-минус один микрон с помощью микротома.

Установите секции на стеклостеки с электростатическим клеем и высушите на воздухе при комнатной температуре в течение ночи. За час до проведения анализа гибридизации РНК NC2 поместите установленные тканевые стекла в решетку для слайдов и запекайте в печи с циркуляцией воздуха при температуре 60 градусов Цельсия. Перед началом анализа гибридизации РНК NC2 убедитесь, что печь для гибридизации настроена на 40 градусов Цельсия.

Тщательно намочите увлажняющую бумагу, удалите остатки воды и закройте лоток для контроля влажности крышкой. Приготовьте 200 миллилитров коммерчески доступного реагента для поиска мишени 1X, добавив 20 миллилитров реагента для поиска мишени 10X в 180 миллилитров воды. Поместите два держателя слайдов в отпариватель.

Наполните один держатель предметного стекла 200 миллилитрами реагента для поиска мишени 1X, а другой — 200 миллилитрами воды. С помощью пароварки нагрейте оба раствора до кипения. Нагрейте буфер для стирки 50X до 40 градусов Цельсия в течение 10-20 минут.

Затем приготовьте три литра буфера для стирки 1X, разбавив 60 миллилитров предварительно нагретого буфера для стирки 50X с 2,94 литрами воды. В вытяжном шкафу приготовьте 50% раствора для противоокрашивания гематоксилина Гилла, добавив 100 миллилитров гематоксилина Джилла на 100 миллилитров воды. Приготовьте реагент для воронения, добавив 1,43 миллилитра от 20 до 30% гидроксида аммония на 250 миллилитров воды.

Предварительно нагрейте целевые зонды до 40 градусов Цельсия в течение 10 минут перед гибридизацией зонда. Доведите семь амплифицирующих реагентов, Amp 0-6, до комнатной температуры. Депарифинизацию образца начинают с извлечения срезов из печи и погружения смонтированных тканевых стекол в ксилол с перемешиванием на пять минут.

Снова депарфинизируйте в свежем ксилоле в течение пяти минут. Обезвоживать в 100% этаноле с перемешиванием в течение двух минут. И повторите еще раз в свежем 100% этаноле в течение двух минут.

Сушите предметные стекла на воздухе при температуре 60 градусов Цельсия в духовке с циркуляцией воздуха в течение пяти минут, пока они полностью не высохнут. Затем инкубируйте секции примерно с четырьмя каплями готовой к использованию перекиси водорода при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы погасить активность эндогенной пероксидазы. Сцедите раствор с горок и дважды промойте их водой.

Ненадолго опустите срезы в предварительно подогретую воду, а затем поместите срезы в 200 миллилитров целевого реактива при температуре 100 градусов Цельсия в отпариватель на 15-30 минут. Удалите предметные стекла из целевого источника и дважды промойте в воде. Опустите в 100% этанол на три минуты.

Затем высушите горки при температуре 60 градусов Цельсия в духовке с циркуляцией воздуха до полного высыхания. Как только слайды высохнут, с помощью гидрофобной ручки нарисуйте гидрофобный барьер размером примерно 0,75 на 0,75 дюйма вокруг секции. Дайте барьеру полностью высохнуть при комнатной температуре в течение одной минуты.

Поместите слайды в держатель слайдов и поместите держатель слайдов в предварительно нагретый лоток с контролируемой влажностью. Добавьте около четырех капель протеазы 3 на каждое предметное стекло и выдерживайте при температуре 40 градусов Цельсия в печи для гибридизации от 15 до 30 минут. Сцедите раствор с горок и дважды промойте их водой.

Чтобы начать процедуру гибридизации зондов, добавьте около четырех капель соответствующего готового к использованию раствора зонда, чтобы покрыть весь срез. Гибридизируйте зонды при температуре 40 градусов Цельсия в печи для гибридизации в течение двух часов. Сцедите раствор со стекол и промойте предметные стекла в 200 миллилитрах 1Х в буфере для стирки при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение двух минут.

Повторите процедуру стирки. Следующим шагом является усиление сигнала путем инкубации секций в серии амплифицирующих реагентов. Добавьте около четырех капель Amp 0, чтобы покрыть всю секцию на каждом предметном стекле, и выдерживайте при температуре 40 градусов Цельсия в печи для гибридизации в течение 30 минут.

Затем сцедите раствор и промойте предметные стекла в 200 миллилитрах 1Х буфера для стирки при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение двух минут. Повторите процедуру стирки. Таким же образом инкубируйте секции в усилителях с 1 по 6 при температуре и в течение времени, указанных на этой схеме.

После того, как предметные стекла были обработаны серией амплификационных реагентов, приготовьте рабочий раствор красителя Fast Red. Добавьте в пробирку подходящий объем красителя Fast Red-B и красителя Fast Red-A и хорошо перемешайте. Сцедите лишнюю жидкость со стекол и добавьте на предметные стекла рабочий раствор красителя Fast Red.

Выдержите предметные стекла в лотке с крышкой при комнатной температуре в течение 10 минут. Через 10 минут сцедите раствор Fast Red и дважды промойте предметные стекла, опуская вверх и вниз воду из-под крана. Чтобы уравновесить срезы тканей, погрузите предметные стекла в 50% раствор гематоксилина Джилла при комнатной температуре на две минуты.

Промойте горки водой из-под крана, повторяя это несколько раз, пока горки не станут прозрачными, а участки останутся фиолетовыми. Опустите предметные стекла в воду 02% аммиака два-три раза для воронения. Замените нашатырную воду водопроводной водой и промойте горки от трех до пяти раз.

Сушите горки в духовке с циркуляцией воздуха при температуре 60 градусов Цельсия в течение 15 минут до полного высыхания. Нанесите одну-две капли монтажного реагента на защитное стекло и поместите предметное стекло на защитное стекло, избегая скопления пузырьков воздуха. Сушите слайды на воздухе не менее пяти минут.

Наконец, рассмотрите предметные стекла под стандартным светлопольным микроскопом. Зондовые переходы с двойным Z-образцом были разработаны для определения статуса EGFRvIII в двух образцах глиобластомы с фиксированным формалином, или образцах глиобластомы FFPE. Оба зонда дикого типа обнаружили сигнал в обоих образцах, указывающий на то, что два образца экспрессируют EGFR дикого типа.

Однако мутантный зонд обнаружил сигнал только в положительном образце EGFRvIII, а не в отрицательном образце EGFRvIII. В анализ включали положительные и отрицательные контрольные пробы. Когда был проведен анализ короткой мишени на клетках Jurkat, полученных в виде клеточной гранулы FFPE с использованием антисмысловых или сенсорных зондов, нацеленных на последовательности красным цветом, наблюдалось надежное окрашивание с помощью антисмысловых зондов как для CDR3-альфа, так и для CDR3-бета, в то время как сенсорные зонды обнаруживали мало или вообще не обнаруживали сигнала.

dapB использовали в качестве отрицательного контроля. Анализ также способен обнаруживать точечные мутации. В этом примере были разработаны два зонда, один из которых предназначен для обнаружения мутировавшей последовательности EGFR L858R, а другой — для обнаружения последовательности дикого типа EGFR L858.

Мутантный зонд обнаружил сигнал в клеточной линии H1975, которая является гетерозиготной по мутации EGFR L858R, но не обнаружил сигнал в клеточной линии H2229, которая экспрессирует только дикий тип EGFR L858. Зонд дикого типа обнаруживает сигнал в обеих клеточных линиях. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о правильной фиксации тканей, использовании положительных и отрицательных контрольных зондов и использовании системы обработки предметных стекол в печи для гибридизации.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ИГХ с клеточными маркерами, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение специфической для типа клеток экспрессии сплайс-вариантов или коротких целевых последовательностей. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии, онкологии и других областей для изучения альтернативных событий сплайсинга в тканевом контексте, идентификации пространственно картированных точечных мутаций и визуализации высокогомологичных и коротких последовательностей in situ. Не забывайте, что работа с нейтральным буферным формалином и ксилолом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу и ношение средств индивидуальной защиты.