Функциональная характеристика Carboxylesterases в стойкие инсектициды дома мух, Муха Domestica

Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области токсикологии насекомых, например, все ли экспрессируют гены метаболической детоксикации, участвующие в устойчивости к инсектицидам? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет получать более крупные масштабы белков и характеризовать функцию этих белков в метаболизме инсектицидов in vitro. Демонстрировать процедуры будет Сюэчунь Фэн, аспирант моей лаборатории.

Докторская диссертация Сюэчэня посвящена характеристике функции карбоксилэстеразы в устойчивости к паразитам домашних мух, Musca domestica. Для начала смешайте один микролитр входной плазменной ДНК GFP с пятью микролитрами коммерчески доступной линейной ДНК C-term в 250 микролитровых ПЦР-пробирках. Затем добавьте по два микролитра коммерчески доступной смеси для рекомбинации лямбда в каждую из пробирок ПЦР.

Аккуратно перемешайте трубки и инкубируйте их при температуре 25 градусов Цельсия в течение ночи. Высейте два миллилитра культуры клеток SF9 логарифмической фазы роста насекомых равномерно в лунки клеточной культивальной тарелки. Затем дайте ячейкам прикрепиться не менее трех часов при комнатной температуре, в вытяжке.

С помощью инвертированного фазового микроскопа при 250-кратном увеличении проверьте крепление клетки. Затем удалите среду для клеточных культур и замените ее двумя миллилитрами среды для насекомых Grace. После этого приготовьте растворы трансфекционной смеси А и В согласно текстовому протоколу.

Затем аккуратно перемешайте смеси для трансфекции А и В, постукивая по трубкам. Выдерживайте смесь при комнатной температуре, в вытяжке, в течение 35 минут. Далее добавьте смесь по каплям на засеянные ячейки.

Заклейте лунки скотчем и инкубируйте клетки при температуре 27 градусов Цельсия на ночь. Замените два миллилитра среды для насекомых Грейс двумя миллилитрами полной среды для выращивания. Затем добавьте 100 микромолей Ганцикловира в каждую лунку.

Заклейте лунки скотчем и инкубируйте клетки при температуре 27 градусов Цельсия в течение 72 часов. Через 72 часа после заражения соберите среду из каждой лунки и переложите ее в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Затем центрифугируйте пробирки при температуре 1500 раз по G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Добавьте в лунку один миллилитр полной питательной среды и с помощью микроскопа с флуоресцентным светом наблюдайте за признаками инфекции клеток на стадии амплификации бакуловируса Р1. Переложите надосадочную жидкость в новые центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и храните их при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. После этого равномерно засейте два миллилитра логарифмической фазы роста насекомого SF9 в лунки клеточной культуральной тарелки.

Дайте ячейкам прикрепиться не менее трех часов при комнатной температуре, в вытяжке. Внесите пять микролитров вируса P1 в лунки, засеянные клетками, затем добавьте 100 микромолей ганцикловира в каждую лунку. Запечатайте лунки и инкубируйте клетки в течение 72 часов при температуре 27 градусов Цельсия.

Во-первых, культивируйте пять миллилитров клеток SF9 насекомых с полной питательной средой в необработанных колбах T25. Затем добавьте 25 микролитров исходного раствора вируса P1, чтобы заразить культуру клеток, в течение 48 часов, с легким встряхиванием, при температуре 27 градусов Цельсия. С помощью ацетонитрила готовят серийные разведения 100 миллимола перметрина.

Затем засейте 200 микролитров инфицированной клеточной культуры, добавленной с 300 микролитрами полной питательной среды, в 24-луночную пластину. Следим за тем, чтобы перметрин полностью растворился в ацетонитриле, и равномерно доставил его в каждую лунку пластины. После добавления перметрина аккуратно встряхните пластину, чтобы полностью смешать перметрин в среде.

После этого заклейте пластину скотчем, и выдержите пластину при температуре 27 градусов Цельсия в течение 48 часов в темных условиях. Извлеките среду для культивирования клеток из планшета, не нарушая нижний прикрепленный слой клеток. Добавьте по 200 микролитров реагента ММТ в каждую лунку.

Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов, пока в каждой лунке не образуются темно-фиолетовые осадки. Добавьте по 500 микролитров ДМСО в каждую лунку, чтобы полностью растворить осадки. Затем переложите по 200 микролитров растворенного раствора, в каждую лунку 96 луночной пластины.

Полное растворение осадка в ДМСО имеет решающее значение для точности результатов. После добавления ДМСО в образцы в планшете, образцы будут промыты с помощью пипетки несколько раз, пока осадок полностью не растворится. Наконец, используйте считыватель микропланшетов для измерения значений поглощения пластины на 540 нанометрах.

На стадии Р1 коэффициент инфицирования низкий. На стадии Р2 коэффициент инфицирования был значительно повышен. На стадии Р3-инфекции почти у всех клеток наблюдались симптомы отслоения от клеточной культуральной пластины, увеличения диаметра клеток, а также прекращения клеточного роста.

Основываясь на обнаруженных значениях абсорбции, клетки, экспрессирующие Md альфа E7, показали значительно более высокую жизнеспособность, по сравнению с контрольными клетками CAT. При проведении этой процедуры важно предотвратить загрязнение клеток на всех этапах, протирая поверхность материалов, таких как бутылки и пробирки, 70-процентным этанолом перед проведением клеточных экспериментов. После этой процедуры могут быть выполнены некоторые другие методы, такие как моделирование гомологии и темновой анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как взаимодействие между белком карбоксилэстеразы и перметриновым лигандом.

Этот метод проложил путь исследователям в области токсикологии насекомых к изучению функциональной характеристики генов и механизмов устойчивости насекомых к инсектицидам. Не забывайте, что работа с инсектицидом может быть очень вредной, и при проведении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как перчатки и лабораторные халаты.