Изоляция и определение внесосудистой иммунных клеток сердца

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о составе субпопуляций иммунных клеток в сердце как в стационарном, так и в болезненном состоянии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для точного иммунофенотипирования популяций сердечных иммунных клеток, включая очень редкие субпопуляции. Этот протокол относительно прост.

Тем не менее, инъекции в хвостовую вену могут быть сложными, поэтому важно практиковать эту технику, пока вы не почувствуете себя комфортно, прежде чем использовать экспериментальных животных. Чтобы пометить циркулирующие лейкоциты, загрузите 200 микролитров свежеприготовленного мышиного флуорофор-конъюгированного анти-CD45 антитела в PBS в инсулиновый шприц 28,5-го калибра и предварительно разогрейте восемь 12-недельных мышей на циркулирующем водяном одеяле, установленном до 35-41 градуса Цельсия, в течение 5-10 минут. Когда хвостовая вена расширилась, зафиксируйте первое животное в кормовом положении в соответствующем удерживающем устройстве.

Если хвостовые вены недостаточно расширены, окуните хвост в воду с температурой от 36 до 40 градусов Цельсия на одну-две минуты. Когда хвостовые вены будут готовы, проведите мазок с места инъекции марлей, пропитанной на 70% этанолом, и иммобилизуйте основание хвоста указательным и средним пальцами и среднедистальную область хвоста большим и безымянным пальцами. Держа иглу скошенной стороной вверх и параллельно вене, введите иглу в расширенную хвостовую вену и внутривенно введите весь объем антитела.

Затем дайте антителу циркулировать в течение пяти минут перед гуманной эвтаназией. Чтобы извлечь сердце, распылите на мышь 70% этанола и приподнимите кожу живота, чтобы открыть брюшную полость вдоль вентральной средней линии от бедер до грудины. Откройте брюшину и сдвиньте печень, чтобы обнажить диафрагму.

Разрежьте диафрагму и ребра по обе стороны от средней линии, стараясь не проколоть легкие и сердце. Снимите ребра, чтобы обнажить сердце, прежде чем надрезать левое и правое предсердия. Осторожно захватив основание сердца щипцами, введите иглу 21-го калибра, прикрепленную к 60-миллилитровому шприцу, в левый желудочек возле верхушки и перфузируйте сердце от 15 до 20 миллилитров холодного PBS.

Правильная перфузия сердца имеет важное значение для предотвращения внутрисосудистых загрязнений. Поэтому позаботьтесь о том, чтобы вскрыть и перфузировать сердце сразу после эвтаназии, чтобы избежать загрязнения из-за свернувшейся крови. После перфузии правого желудочка, как показано выше, следует наблюдать белые легкие и бледную печень.

Удерживая основание сердца щипцами, осторожно подтяните сердце вверх и разрежьте основные легочные артерии и вены, аорту и перикардиальный мешок, чтобы отделить сердечную ткань. Аккуратно удерживая сердце между большим и указательным пальцами, тщательно очистите сердце чистым безворсовым бумажным полотенцем и с помощью щипцов удалите предсердия и любые остатки любых крупных артерий и вен или других загрязнений. Поместите очищенное сердце в пятисантиметровую пластиковую посуду и добавьте 50 микролитров холодного ПБС.

С помощью изогнутых ножниц для препарирования измельчите сердцевину до тех пор, пока не останется видимых кусочков и ткань не приобретет гладкую густую консистенцию. С помощью изогнутых щипцов перенесите ткань в двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие 800 микролитров холодного DMEM. Принимайте добавки с коллагеназой, ДНКазой и гиалуронидазой и инкубируйте в течение 45–60 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 50 оборотах в минуту.

По окончании переваривания переваривайте образцы в течение 20 секунд и сразу же помещайте их на лед. Образец всегда следует хранить при температуре четыре градуса Цельсия, если не указано иное, так как некоторые поверхностные антигены могут быть интернализованы, если оставить их при комнатной температуре. Затем предварительно намочите 140-микролитровое сетчатое фильтр в 50-миллилитровой конической пробирке на образец с одним миллилитром холодного ГБВ.

С помощью пипетки объемом один миллилитр пипетируйте образцы до тех пор, пока тканевые суспензии не станут однородными и не забьют наконечник пипетки, и добавьте гомогенизированные образцы в фильтры. Медленно промойте образцы через фильтры с 12-14 миллилитрами холодного ГБД на образец и переложите отфильтрованные образцы в маркированную 15-миллилитровую коническую пробирку со льдом. О хорошем пищеварении свидетельствует отсутствие сердечных остатков в фильтре.

Соберите образцы методом центрифугирования и удалите надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр буфера для лизиса калия хлорида аммония в каждый образец. Повторная суспендия образцов с кратковременным вортексированием с последующей пятиминутной инкубацией при комнатной температуре.

Затем прекращают гемолиз пятью-восемью миллилитрами холодного HBSS. Соберите образцы методом центрифугирования и повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре флуоресцентно-активируемой сортировки клеток или буфере FACS и переложите в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра для еще одного центрифугирования. Для анализа образцов методом проточной цитометрии ресуспендировали гранулы в 50 мкл анти-CD16/CD32 антител и блокатора моноцитов для снижения связывания неспецифических антител в течение 15-минутной инкубации при комнатной температуре.

Не промывая, добавьте в каждый образец по 50 микролитров мастер-смеси антител при перемешивании для 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия в защищенном от света месте. В конце инкубации промойте образцы 600 микролитрами буфера FACS на пробирку и повторно суспендируйте гранулы в 300 микролитрах свежего буфера FACS или 1% параформальдегида. Затем анализируют сердечные лейкоциты методом проточной цитометрии в соответствии со стандартными протоколами проточного анализа.

Анализ суспензии сердечных одиночных клеток с помощью проточной цитометрии требует предварительного гейтирования CD45 для дифференцировки иммунных клеток от неиммунных клеток сердца с последующим газоблокированием одиночных клеток и малых размеров. Макрофаги, идентифицируемые по экспрессии CD64, являются основной популяцией иммунных клеток сердца, представляя от 60 до 70% всех иммунных клеток. Обычные сердечные дендритные клетки представляют собой CD64-отрицательные клетки, которые экспрессируют высокие уровни MHC класса II и CD11c.

Эти клетки могут быть дополнительно разделены на основе их экспрессии CD103 или CD11b и представляют собой гораздо меньшую сердечную субпопуляцию по сравнению с макрофагами. Использование проточной цитометрии одноклеточной суспензии миокарда позволяет изучать небольшие субпопуляции лейкоцитов в сердце. Например, используя анализ проточной цитометрии для сравнения иммунных клеток миокарда дикого типа с мышами с дефицитом Batf3, можно подтвердить отсутствие CD103-положительных дендритных клеток у нокаутированных животных.

Кроме того, этот анализ выявил отсутствие существенных изменений состава других сердечных популяций у животных с дефицитом Batf3, демонстрируя степень чувствительности, которая может быть достигнута с помощью этого комбинированного метода ферментативного и механического пищеварения для получения суспензии одной клетки. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно всегда учитывать жизнеспособность вашего клеточного изолята. Поэтому мы рекомендуем оптимизировать время и концентрацию ферментов в пищеварении в соответствии с условиями вашего эксперимента.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование РНК одиночных клеток, функциональные анализы и выделение магнитных шариков, чтобы ответить на дополнительные вопросы о функциях выделенных клеток.