Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Целью этого протокола является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, которые экспрессируют эндогенные гибридные белки, слитые с концевыми флуоресцентными метками N или C на концах. Для достижения желаемого результата мы используем систему CRISPR-Cas9 и подход, основанный на рибонуклеопротеине, с использованием белка S.pyogenes Cas9 дикого типа и синтетической CRSPR РНК и тракрРНК из двух частей. Этот РНП доставляется совместно с желаемой последовательностью флуоресцентных меток в качестве донорской плазмиды с помощью электропорации.

Предположительно отредактированные клетки, экспрессирующие флуоресцентный меченый белок, обогащаются FACS. Затем генерируются клональные линии для анализа точных результатов редактирования. Этот протокол редактирования генов имеет много преимуществ по сравнению с традиционными конструкциями сверхэкспрессии.

Поскольку флуоресцентная метка вводится в геном, субклеточная локализация и динамика полученного гибридного белка могут быть изучены под эндогенным регуляторным контролем. Здесь мы используем индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в качестве модельной системы, поскольку она позволяет нам изучать меченые белки в диплоидных нетрансформированных клетках. Кроме того, поскольку клетки могут быть дифференцированы в несколько типов клеток, как показано здесь кардиомиоцитарные клетки, этот подход дает возможность создавать и изучать меченые белки в различных изогенных клеточных контекстах.

Тем не менее, при тщательной оптимизации этот протокол может быть адаптирован для редактирования геномов других типов клеток млекопитающих. Здравствуйте, меня зовут Аманда Хаупт, я вхожу в команду по стволовым клеткам и редактированию генов в Институте клеточных наук Аллена. На сегодняшний день мы использовали этот подход для создания более 35 различных клеточных линий, экспрессирующих эндогенные гибридные белки.

Мы используем их для изучения широкого спектра уникальных клеточных структур и процессов. Этот подход оказался успешным для 95% локусов, предпринятых на сегодняшний день с нашей группой. Этот метод будет особенно полезен клеточным биологам, которые заинтересованы в лучшем понимании динамики белка в живых клетках.

Однако, как только отредактированные клональные линии сгенерированы, возможности для изучения безграничны. С помощью этого метода мы можем последовательно идентифицировать клоны, которые имеют моноаллельные флуоресцентные белковые метки без каких-либо других нарушений в геномной последовательности. Иногда нам также удается получить биаллельно отредактированные клоны.

В этом видео мы покажем некоторые из ключевых этапов трансфекции, обогащения FACS и выделения клональных клеточных линий, экспрессирующих эндогенно регулируемые флуоресцентные гибридные белки. За два-три часа до трансфекции обработайте ИПСК десятью микромолярными ингибиторами ROCK, добавленными в питательную среду. Это будет способствовать выживаемости после электропорации.

После этой процедуры клетки будут иметь колючий вид. Клетки должны быть удалены из тканевой компенсационной пластины с использованием одной области диссоциации клеток и клеточной суспензии, собранной в коническую трубку перед трансфекцией. Приготовьте аликвоту в соотношении 1,84 умножить на 10 на шесть клеток для каждого экспериментального состояния, которое будет трансфицировано.

Приготовьте пробирки с рибонуклеопротеиновым комплексом для каждой трансфекции, добавив 2,88 микролитра 10 микромолярной направляющей РНК и 2,88 микролитра 10 микромолярного Cas9 в 1,5 мил пробирки. Выдерживать при комнатной температуре минимум 10 минут, максимум один час. Гранулируйте ячейку аликоты, приготовленную на предыдущем этапе, при 211 умноженных на G в течение трех минут при комнатной температуре.

Затем аспирируйте надосадочную жидкость и спешите вращать клеточную гранулу в 220 микролитрах электропориционного буфера. Добавьте 220 микролитров ресуспендированных клеток в предварительно подготовленную пробирку с интенсивностью 1,5 мил РНП. Добавьте 4,6 микролитра одного микрограмма на микролитр донорской плазмиды.

С помощью наконечника нуклеофекции и пипетки смешайте два содержимого два-три раза, затем перенесите сотню микролитров суспензии в подготовленное устройство для электропорации. Избегайте попадания пузырьков в кончик. Подайте напряжение тринадцать сотен вольт на один импульс продолжительностью тридцать миллисекунд.

Аккуратно переложите суспензию в подготовленную шестилуночную пластину вращательными движениями. Распределите ячейки, осторожно перемещая пластину из стороны в сторону и спереди назад. После повторения для всех условий эксперимента и контроля инкубируйте трансфицированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 24 часов, меняя среду на обычную питательную среду без ингибитора ROCK через 24 часа.

Затем продолжайте кормить ИПСК каждые 24 часа в течение 72–96 часов, контролируя их слияние. Когда hiPSCs достигает от 68 до 80% конфлюенции, переходят к обогащению FACS. За два-три часа до трансфекции обрабатывайте ИПСК 10-микромолярным ингибитором ROCK, добавленным в питательную среду для повышения выживаемости после обогащения FACS.

Чтобы отсортировать клетки, удалите их из планшета с помощью реагента для диссоциации одиночных клеток, затем отфильтруйте суспензию hiPSC через фильтр с ячейкой 35 микрон в полистирольные пробирки с круглым дном. Сортируйте ячейки с помощью прямого и бокового рассеивания, включая: высоту против ширины, триплеты, мусор и дублеты. Используйте контрольные ячейки динамического буфера для установки положительного вентита FP, например, чтобы менее 1,1% ячеек буфера попадали в вентиль.

При сортировке стволовых клеток адаптируйте настройки прибора, чтобы способствовать выживанию клеток, как предлагается в разделе обсуждения. Типичный сбой в эффективности, определяемый процентом FP-положительных клеток с помощью FACS, может варьироваться от 0,1% до 5%. Сортируйте клетки в полипропиленовую трубку объемом от 1,5 до 15 мил, содержащую от 0,5 до 2 мил питательной среды комнатной температуры, дополненную 10 микромолярным ингибитором ROCK. Центрифугируйте собранные клетки при температуре 211 G в течение трех минут при комнатной температуре.

Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах питательной среды с добавлением 10 микромолярного ингибитора ROCK. Переведите до трех тысяч различных ячеек в одну лунку из свежей матрицы, покрытой 96-луночной пластиной. Инкубируйте отсортированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2 в течение 24 часов, изменяя среду на питательную среду с добавлением 5 микромолярного ингибитора ROCK через 24 часа.

Затем через 48 часов продолжайте кормить клетки обычной питательной средой, без ингибитора ROCK, каждые 24 часа в течение 72-96 часов, контролируя слияние. Как только клетки станут достаточно зрелыми, чтобы их можно было вывести из 96-луночного планшета, мы рекомендуем постепенно пропускать их в более крупные планшеты. Так, например, из одной лунки 96-луночной пластины переместите их в одну-две лунки 24-луночной пластины.

А затем в 6-луночную пластину и так далее, пока у вас не будет достаточно ячеек для последующих целей. Обычно три-четыре миллиона клеток минимум. Чтобы создать клональные линии из обогащенной FACS популяции карательно отредактированных клеток, перейдите в суспензию одиночных клеток и поместите десять тысяч клеток на 10-сантиметровую пластину и дайте колониям расти в течение пяти-семи дней.

Когда колонии видны макроскопически, они достаточно велики, чтобы их можно было изолировать. На препарирующем микроскопе используйте пипетку P200 для аккуратного соскабливания и аспирации отдельных колоний с поверхности пластины. Перенесите объем, содержащий колонию, в одну лунку 96-луночного планшета.

После того, как все колонии будут переведены, инкубируйте планшет в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 24 часов. Смените среду на обычную питательную среду без ингибитора ROCK через 24 часа. Затем продолжайте кормить клетки каждые 24 часа в течение 72-96 часов, пока колонии не увеличатся в размерах примерно в три раза.

Клетки должны быть выращены и пропущены в 96-луночных планшетах, чтобы получить достаточное количество клеток для криоконсервации антализа для экстракции геномной ДНК. Более подробную информацию см. в письменном протоколе. Для прохождения в 96 луночных планшетов используют восьмиканальный аспиратор для удаления и отбрасывания среды из первой колонны.

С помощью многоканальной пипетки P200 добавьте около 200 микролитров DPBS в первую колонку пластины для промывки клеток. С помощью восьмиканального аспиратора затем удалите и выбросьте смывку DPBS из первой колонны. Затем добавьте в первую колонку 40 микролитров диссоциационного реактива.

Повторите эти шаги, работая по одной колонке за раз, в общей сложности до шести колонок 96-луночного планшета. Меняйте советы, чтобы не загрязнить колодцы перекрестно. Поместите планшет в инкубатор на три-пять минут с момента добавления диссоциационного реагента в первую колонку.

Когда клетки в первой колонке планшета начнут отрываться от дна, с помощью многоканальной пипетки P200 добавьте 160 микролитров DPBS в первую колонку и осторожно разрастите ячейки в положениях «12 часов», «3 часа», «6 часов» и «9 часов» каждой лунки. Перенесите весь объем с помощью суспензии ячеек на 96-луночный планшет с V-образным дном. Повторите эти действия для остальных колонок, в которых есть диссоциационный реагент, меняя наконечники, чтобы не допустить перекрестного загрязнения лунок.

Вращайте пластину с V-образным дном в центрифуге при температуре 385 умножить на G в течение трех минут при комнатной температуре. Подводники, показанные до этого момента для пропускания 96 лунок, выполняются таким же образом при каждом прохождении ячеек в этом формате планшета. Далее мы покажем вам, как действовать, если вы готовы криоконсервировать клетки в формате 96 лунки.

Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с письменным протоколом. После этапа центрифугирования, показанного в предыдущем разделе, аспирируйте надосадочную жидкость с помощью многоканальной пипетки P200, а затем повторно суспендируйте в 60 микролитрах питательной среды с добавлением 10 микромолярного ингибитора ROCK. Повторите для всех колодцев, меняя наконечники, чтобы не допустить перекрестного загрязнения.

Перенесите 30 микролитров клеточной суспензии в 96-луночный планшет для культуры тканей, не покрытый матригелем. Перелейте оставшиеся 30 микролитров суспензии в сестринскую пластину, затем быстро добавьте по 170 микролитров замораживающего буфера в каждую лунку, не перемешивая. Обратите внимание, что этот процесс выполняется в дубликатах сестринских пластин, так что резервная популяция клеток существует после размораживания одной из отдельных пластин

Помещение криоконсервированных клеток только в каждую вторую колонку 96-луночного планшета позволяет ускорить размораживание. Оберните тарелку парапленкой и поместите ее в пенопластовый ящик комнатной температуры с крышкой. Поместите всю коробку в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Через 24 часа пластины можно переносить из пенопластовой коробки и сортировать при температуре минус 86 градусов по Цельсию в течение четырех недель. Криоконсервация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в формате 96 лунок позволяет осуществить временной перерыв в культуре клеток. Исследователь может провести анализы геномной валидации на клональных рудниках, чтобы определить генетически желательные клоны для размораживания для будущих исследований.

Через четыре дня после трансфекции линии WTC hiPSC специфическим белком целевой направляющей РНК Cas9 и тщательно разработанной донорской матрицей плазмиды было обнаружено, что 0,95% клеток экспрессируют GFP. FACS был использован для сортировки всех GFP-положительных клеток в виде обогащенной популяции. Предварительные микроскопические исследования выявили ожидаемую локализацию гибридного белка B1 ядерного ламина mEGFP в ядерной оболочке.

Флуоресцентно меченный белок наблюдался примерно в 95% клеток с различной интенсивностью. После генерации клональных линий были получены клоны с равномерной интенсивностью mEGFP и в дальнейшем проанализированы для точного редактирования. В заключение мы показали метод трансфекции для редактирования генов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для экспрессии эндогенно регулируемых флуоресцентных гибридных белков.

Поскольку типичная неэффективность детонации невелика, некоторые стратегии обогащения, такие как показанный здесь метод FACS, приводят к популяции предположительно отредактированных клеток, экспрессирующих гибридный белок. Обогащенная популяция может быть использована для биологических исследований или могут быть получены клональные линии, как описано в этом методе, что позволяет идентифицировать клеточные линии, которые точно отредактированы генами. Важно помнить, что двухцепочечные разрывы в геноме, вызванные Cas9, часто восстанавливаются неточно, несмотря на включение метки в предполагаемый локус.

Кроме того, в моноаллельно отредактированных клонах непомеченный аллель часто содержит инделы, скорее всего, вызванные негомологичным восстановлением торцевых соединений. Эти результаты подчеркивают важность генетической валидации после того, как CRISPR Cas9 был обнаружен только благодаря анализу генома клональных клеточных линий. Экспрессия ожидаемого гибридного белка сама по себе не гарантирует точного редактирования.

При использовании этого протокола для редактирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека соблюдайте рекомендации, подробно изложенные в письменном протоколе, чтобы обеспечить бережное обращение с клетками для оптимальной выживаемости клеток и минимальной спонтанной дифференцировки. Мы надеемся, что это видео и связанный с ним протокол и список материалов помогут вам провести аналогичные эксперименты в вашей собственной лаборатории с вашим любимым белком. Спасибо за просмотр.