В пробирке Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об организации клетки и мембранах, например, какую роль играют геометрические сигналы в этом процессе. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет точно контролировать все аспекты, влияющие на формирование паттерна, такие как концентрация белка. Для начала сгенерируйте многослойные везикулы, как описано в текстовом протоколе.

Теперь заморозьте-разморозьте липиды в течение 7-10 циклов, сначала подготовив стакан с водой при температуре от 70 до 99 градусов Цельсия на горячей плите, а также контейнер с жидким азотом. Держите флакон в жидком азоте большим пинцетом до тех пор, пока азот не перестанет кипеть. Затем переложите флакон в горячую воду до полного оттаивания раствора.

Повторяйте эти действия до тех пор, пока липидная смесь не станет прозрачной для глаза, в зависимости от смеси. Далее соберите липидный экструдер и предварительно промойте систему с минимальным буфером. Выдавите липидную смесь от 35 до 41 раза через мембрану с размером пор 50 нанометров.

Убедитесь, что вы закончили на нечетном количестве проходов, чтобы избежать агрегатов, которые никогда не пересекали мембрану. Распределите стеклянные покровные стекла на перевернутой стеклянной чашке Петри или другой инертной поверхности. Стеклянной пипеткой добавьте семь капель концентрированной серной кислоты в центр каждого покровного стекла.

Затем добавьте две капли 50%-ной перекиси водорода в середину кислотных капель. Закройте реакцию и выиграйте не менее 45 минут. Теперь возьмите покровные стекла по отдельности с помощью пинцета и смойте кислоту сверхчистой водой.

Поместите вымытые покровные стекла в антипригарные держатели или аналогичное транспортное средство. Теперь тщательно промойте каждую защитную пленку сверхчистой водой и высушите поверхность сжатым газом. Отметьте чистую сторону покровного стекла несмываемым маркером.

Чтобы собрать камеру, сначала острыми ножницами отрежьте и выбросьте крышку и коническую часть реакционной пробирки объемом 0,5 миллилитров. Затем нанесите УФ-клей на верхний край трубки и равномерно распределите клей с помощью наконечника пипетки. Приклейте трубку вверх дном к чистой стороне покровного стекла.

Наконец, отверждите УФ-клей, поместив несколько камер под 360-нанометровую лампу или светодиод на пять-15 минут. Для образования поддерживаемого липидного бислоя предварительно нагрейте тепловой блок до 37 градусов Цельсия и инкубируйте две миллилитровые реакционные пробирки с буфером Min или SLB в одной пробирке на камеру. Вдуйте азот в собранные и отвержденные камеры, чтобы удалить пыль или другие частицы, которые могли оседать во время УФ-отверждения и сборки.

Затем поместите камеры на тепловой блок. Разведите аликвоту прозрачных липидов на 20 микролитров со 130 микролитрами буфера Мин, построив рабочую концентрацию 0,53 миллиграмм на миллилитр. Добавьте по 75 микролитров липидной смеси в каждую камеру.

Теперь установите таймер на три минуты. Во время инкубации везикулы лопаются на поверхности гидрофильного стекла и сливаются, образуя когерентный SLB. По прошествии 60 секунд добавьте по 150 микролитров минимального буфера в каждую камеру.

По истечении оставшихся 120 секунд промойте каждую камеру, добавив 200 микролитров буфера Min или SLB, тщательно пипетируйте вверх и вниз несколько раз, удаляя и добавляя еще 200 микролитров. После того, как каждая камера будет промыта по одному разу, приступайте к тщательной промывке первой камеры, пока не будут израсходованы два миллилитра буфера. Промывка поддерживаемых липидных бислоев требует некоторого опыта, чтобы усовершенствовать степень движений в камере и найти правильную интенсивность промывки.

Чтобы получить микроструктуры PDMS из кремниевых пластин с рисунком, сначала используйте пластиковый стаканчик для взвешивания 10 граммов основы PDMS и одного грамма сшивающего агента PDMS. Используйте смесительное устройство для смешивания и дегазации смеси PDMS. Теперь с помощью наконечника для дозатора капните небольшое количество PDMS непосредственно на структуру кремниевой пластины.

Немедленно наденьте покровное стекло 1 на каплю PDMS и возьмите верхний конец чистого наконечника пипетки, чтобы аккуратно прижать покровное стекло к силиконовой пластине. PDMS должна быть тонко распределена между покровным стеклом и кремниевой пластиной. Поместите с покровными стеклами в духовку и отверждайте PDMS в течение трех-четырех часов или на ночь при температуре 75 градусов Цельсия.

Далее достаньте из духовки и дайте ей остыть до комнатной температуры. Лезвием бритвы осторожно снимите покровное стекло с прикрепленной PDMS с силиконовой пластины. Теперь прикрепите пластиковую камеру к PDMS, как описано ранее для стекла.

Возьмите покровные стекла с прикрепленной камерой и поместите в плазменный очиститель с кислородом в качестве технологического газа. Очистите покровные стекла плазмой. В этой работе использовалось 30% мощности и давление кислорода 0,3 миллибара в течение одной минуты.

Теперь приготовьте SLB в камере, как описано ранее на стекле. Для проведения анализа самоорганизации необходимо отрегулировать объем буфера в камере до 200 микролитров Мин буфера, за вычетом количества белка и раствора АТФ. Затем добавьте MinD, помеченный MinD, MinE, а при желании и MinC, и аккуратно перемешайте компоненты с помощью пипетирования.

Теперь добавьте 2,5 миллимоляра АТФ, чтобы начать самоорганизацию MinDE. В течение следующих 10–30 минут проверьте регулярное формирование паттерна MinDE и правильно сформированные микроструктуры на флуоресцентном микроскопе. Когда сформируются регулярные шаблоны MinDE, аккуратно дважды пипетируйте вверх и вниз, чтобы смешать компоненты.

Удалите большую часть буфера с помощью пипетки объемом 100 микролитров, а затем осторожно удалите оставшуюся часть с помощью пипетки объемом 10 микролитров. Чтобы увеличить время визуализации, вставьте увлажненный кусок губки внутрь камеры. Следите за тем, чтобы губка не соприкасалась с поверхностью покровного стекла.

Немедленно закройте камеру крышкой, чтобы избежать высыхания остатков буфера в микроструктурах. Перед визуализацией микроструктур убедитесь, что самоорганизация MinDE остановлена на вершине микроструктуры PDMS, в то время как белки в микрополостях колеблются. В этом репрезентативном видео двухцветная визуализация показывает, как MinD и MinE самоорганизуются в бегущие поверхностные волны, которые соответствуют спиральным узорам на поддерживаемых липидных бислоях.

Здесь одноцветное изображение показывает, как MinD и MinE выполняют колебания полюс-полюс в микроструктурах PDMS. Колебания устанавливают усредненный по времени градиент концентрации MinD с максимальной концентрацией на полюсах отсека и минимальной концентрацией в середине отсека. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как отслеживание отдельных частиц, для определения кинетики связывания мембраны и времени пребывания.

Не забывайте, что работа с раствором пираньи может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как средства индивидуальной защиты.