Проксимальный культуры метод для изучения паракринными сигнализации между ячейками

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области межклеточных коммуникаций о реципрокных паракринных и юкстакринных взаимодействиях между двумя типами клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что это очень простой и воспроизводимый метод, который точно улавливает паракринную сигнализацию в типичных условиях культивирования, в то же время предотвращая эффективную юкстакринную сигнализацию. Применение этого метода распространяется на лучшее понимание механизма перекрестных помех между раковыми клетками и микроокружением опухоли.

Хотя этот метод может дать представление о взаимодействии между раковыми клетками и опухолевой стромой, он также может быть применен к другим системам, таким как заживление ран и ангиогенез. Начните с отделения клеток рака яичников от 80%-ной смеси с одним миллилитром 0,25%-ного трипсина на 40-60 секунд, после чего следует нейтрализация реакции шестью миллилитрами полной питательной среды. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах свежей полной питательной среды.

После подсчета разбавляют клетки до 100 000 клеток рака яичников на миллилитр полной концентрации питательной среды и помещают три инвертированных вкладыша культуры тканей с порами 0,4 мкм, обработанных поликарбонатной мембраной, в каждом экспериментальном условиях в чашку для стерильной культуры тканей соответствующего размера. Промаркируйте вкладыши в соответствии с условиями эксперимента и аккуратно нанесите раковые клетки на дно каждого вкладыша концентрическими кругами, начиная с середины мембраны и двигаясь наружу, образуя купол объемом 800 микролитров. Будьте предельно осторожны при посеве клеток на нижнюю поверхность вкладыша, чтобы купол среды, содержащей клетки, не стекал с краев вкладыша во время инкубации.

Когда все вкладыши будут засеяны, накройте чашку крышкой и осторожно поместите вкладыши в инкубатор для клеточных культур. Примерно через четыре часа отделите ГПМЦ двумя миллилитрами 0,25% трипсина на одну-две минуты с последующей нейтрализацией реакции 12 миллилитрами полной питательной среды. Соберите ГПМЦ центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах полной питательной среды для подсчета.

Разбавьте клетки до 300 000 HPMC на миллилитр полной питательной среды и добавьте 2,5 мл свежей полной питательной среды в каждую лунку шестилуночной питательной пластины. Используя стерильные щипцы, поместите каждую вставку правой стороной вверх в каждую лунку шестилуночного планшета так, чтобы нижние поверхности, прикрепленные к раковым клеткам яичников, были погружены в среду. Затем засейте по 1,5 миллилитра ГПМЦ в лунку каждой вставки.

Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 72 часа. По окончании инкубации осторожно извлеките вкладыши из каждой лунки и промойте обе стороны вкладышей PBS. Поместите каждый вкладыш в новую шестилуночную пластину и добавьте 0,5 миллилитра трипсина в лунки для вкладышей и два миллилитра трипсина в нижние лунки.

Через две минуты при 37 градусах Цельсия добавьте по одному миллилитру полной питательной среды в каждую вставку, и тщательно пипетируйте раствор несколько раз, не разрывая мембрану и не проливая клеточную суспензию в лунку ниже. При пипетировании следует соблюдать осторожность, чтобы не допустить перекрестного загрязнения клеток из одной камеры с другими. Перенесите ресуспендированные клетки в меченую пробирку для сбора и дополнительно нейтрализуйте трипсин с помощью дополнительных двух миллилитров полной питательной среды.

Чтобы собрать клетки на дне вкладышей, промывайте дно мембран два-три раза двумя миллилитрами трипсина из соответствующей лунки шестилуночного планшета так, чтобы отделенные клетки были захвачены в соответствующие лунки. Когда все клетки будут отделены, нейтрализуйте трипсин в каждой лунке шестью миллилитрами свежей питательной среды и перенесите клеточные суспензии в помеченные пробирки для сбора. Затем соберите все клетки центрифугированием и ресуспендируйте гранулы по 0,7 миллилитра реагента для лизиса на основе фенола и гуанидина тиоцианата в каждой пробирке для экстракции и выделения РНК в соответствии со стандартными протоколами.

Проксимальная культура ГПМЦ с клетками рака яичников приводит к увеличению экспрессии фибронектина и трансформирующего фактора роста или TGF бета по сравнению с контрольной ГПМЦ, засеянной на вкладыши в отсутствие раковых клеток. Экспрессия как фибронектина, так и TGF beta one также значительно увеличивается в клетках рака яичников при проксимальной культуре с помощью ГПМЦ по сравнению с контрольными клетками яичников, культивируемыми в отсутствие ГПМЦ. И наоборот, клетки рака яичников, обработанные кондиционированной средой HPMC, демонстрируют значительно сниженную экспрессию фибронектина без изменения экспрессии TGF beta one.

Блокирование TGF beta one нейтрализующим антителом, однако, приводит к значительному снижению экспрессии TGF beta one в клетках рака яичников в проксимальной культуре с HPMC. Интересно, что небольшое увеличение экспрессии TGF beta one наблюдается в контрольных непроксимально культивируемых раковых клетках яичников, вероятно, в качестве компенсаторного ответа. Проксимальная культура с клетками рака яичников незначительно увеличивает экспрессию Е-кадгерина в ГПМЦ, в то время как заметное снижение Е-кадгерина наблюдается в клетках рака яичников, выращенных в непосредственной близости от ГПМЦ, по сравнению с контрольной группой, что еще больше демонстрирует эффективность проксимальной системы культивирования для изучения паракринной сигнализации между клетками рака яичников и нормальными клетками в месте метастазирования.

При попытке выполнить эту процедуру важно оптимизировать количество засеиваемых клеток и продолжительность проксимального посева. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуноблоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы об изменениях в экспрессии белка и активации нисходящих процессинговых сигнальных путей во время совместного культивирования мезотелиальных клеток опухолевых клеток. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области опухолевого микроокружения, иммунологии, биологии развития к изучению взаимных паракринных взаимодействий между клетками через секретируемые факторы.