Бесклеточной и клеточных легких модель для изучения метастазов опухоли

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с прогрессированием опухоли. Модель бесклеточных и клеточных легких ex vivo позволяет формировать первичную опухоль, которая со временем растет и образует циркулирующие опухолевые клетки и метастатические поражения. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет изучать прогрессирование рака в сокращенное время и рост различных типов раковых клеток.

Применение этого метода распространяется и на нашу персонализированную терапию, поскольку опухолевые клетки пациентов могут быть использованы в модели для оценки эффективности терапевтических препаратов, включая иммунные клетки. Начните с крысы под глубоким наркозом. Выбрейте грудь и живот, а кожу протрите тампоном с хлоргексидином.

После вскрытия грудной полости выполнить двустороннюю торакотомию, разрезав переднюю сторону грудной клетки слева в правой части диафрагмы. Держите грудную клетку вверх и введите два миллилитра гепарина 1000 единиц на миллилитр в правый желудочек бьющегося сердца с помощью иглы 27 калибра, чтобы предотвратить образование тромбов в легком. После удаления грудной клетки поместите иглу 18 калибра в левый желудочек в качестве вентиляционного отверстия, чтобы дать кровь выходу, затем используйте иглу 25 калибра для введения 15 миллилитров 12,5 единиц на миллилитр гепаринизированного PBS в правый желудочек.

Далее разрежьте трахею у основания щитовидной железы и аккуратно удалите нисходящую аорту на уровне гемиазиготной вены и ветви аорты у дуги. После удаления блокады сердца и легких из грудной полости отрежьте половину правого и левого желудочков, а затем поместите изготовленную на заказ игольчатую канюлю из нержавеющей стали 18-го калибра через правый желудочек в главную легочную артерию. Закрепите канюлю шелковой завязкой 2-0 и осторожно обнажите правый желудочек и предсердие.

Начните с запуска гепаринизированного PBS при физиологическом перфузионном давлении 30 миллиметров ртутного столба до тех пор, пока он свободно не потечет в бутылку блока децеллюляризации, затем присоедините блок сердца-легких к блоку децеллюляризации на конце легочной артерии через канюлю легочной артерии. После 15 минут промывания гепаринизированным PBS замените флакон с гепаринизированным PBS на флакон, содержащий 0,15% додецилсульфата натрия и деионизированную воду, и перфузируйте легкое в течение двух часов для децеллюляризации. После децеллюляризации перфузию деионизированной автоклавной воды через легочный каркас в течение 15 минут, а затем 1% неионогенного детергента в деионизированной воде в течение 10 минут.

Наконец, замените флакон на 500 миллилитров автоклавного PBS с добавлением антибиотиков. Запустите насос со скоростью шесть миллилитров в минуту и перфузируйте легкие в течение 72 часов, после чего бесклеточное легкое будет готово к немедленному использованию. Распылите 70% этанола на картридж насоса и настройте оксигенатор, подключив выходной конец оксигенатора к трубке насоса, а другой конец — к трубке длиной 1,5 фута в биореакторе.

Установите бутылку биореактора в шкаф биобезопасности в асептических условиях. Прикрепите трехсторонний запорный кран к головке женского замка Люэра, чтобы контролировать поток через легочную артерию, затем подсоедините односторонний запорный кран к другой переборке женского замка Люэра для засеивания клеток через трахею. Соедините двухдюймовую трубку снаружи и шестидюймовую трубку внутри бутылки для циркуляции среды.

Подготовьте трубку для подключения баллона биореактора к оксигенатору. Установите фиксатор Luer с наружной резьбой на двухфутовую трубу и прикрепите внутренний люэровский проушин типа T для обеспечения доступности, а наружный замок Luer и внутренний замок Luer прикрепите к двум ножным трубам. Добавьте питательную среду для клеточных культур и перенесите биореактор в инкубатор.

Соедините трубку оксигенатора с двумя открытыми концами, чтобы сделать ее биореактором с замкнутым контуром. Запустите насос со скоростью шесть миллилитров в минуту, чтобы заполнить оксигенатор и трубки питательной средой, чтобы в трубке не было пузырьков воздуха. Как только трубки будут заполнены средой, закройте запорный кран и отсоедините оксигенаторы от обоих концов бутылки биореактора.

Поместите бутылку биореактора в шкаф биобезопасности, пропустите питательную среду через запорный кран и присоедините легочную канюлю легкого каркаса. Если вы работаете с клеточной моделью легких, пропустите децеллюляризацию. Собранное легкое может быть диадически помещено в биореактор.

Снова пропустите питательную среду через односторонний запорный кран, чтобы удалить воздух, и привяжите трахеальную канюлю шелковой нитью к трахее, затем закройте крышку бутылки биореактора. Перенесите биореактор в инкубатор и запустите насос. Используйте питательную среду в течение 10-15 минут, чтобы убедиться, что все доли раздуваются, а легкое выглядит в хорошей форме.

Модифицируйте бесклеточный или клеточный каркас легких следующим образом для метастатической модели. Откройте крышку биореактора с висящим каркасом легких и с помощью шприца с замком Люэра пропустите пять миллилитров питательной среды через трахею. С помощью угловых щипцов пропустите 2-0 шелка через трахею в точке бифуркации.

Перевяжите трахею, идущую к правому легкому в точке бифуркации, и проверьте свободный поток среды через трахею в левое легкое путем прохождения питательной среды. Приготовьте 50 миллилитров клеток рака легких, таких как A549 или H1299, в полной питательной среде RPMI 1640 в концентрации от двух до трех миллионов клеток на миллилитр. Установите 20-миллилитровый шприц с замком Люэра поверх канюли трахеи и добавьте в шприц 15 миллилитров клеток.

Позвольте клеточной суспензии пройти через доли легких под действием силы тяжести. Добавьте остальные ячейки, прежде чем через них пройдут пузырьки воздуха. После посева выньте шприц и подождите 15 минут, затем добавьте свежую среду в биореактор.

Верните его в инкубатор и, удалив все пузырьки воздуха, проденьте легочный каркас со скоростью шесть миллилитров в минуту. Гистопатология интактного легкого показывает альвеолы и пневмоциты. Как видно на рисунке, децеллюляризация приводит к полному удалению клеток легких, а гистопатология бесклеточных легких выявляет неповрежденную базальную мембрану.

Окрашивание децеллюляризованного легкого пентахромом и эластином по методу Мовата обнаруживает наличие коллагена, фибрина и эластина с неповрежденной сосудистой сетью и бронхами. Анализ ДНК децеллюляризованного легкого показывает снижение содержания ДНК более чем на 99%Бесклеточное легкое можно использовать непосредственно в биореакторе для культивирования клеток. Гистологический анализ показывает наличие опухолевого роста.

При попытке этой процедуры важно помнить о введении гепарина в правый желудочек сердца. После этой разработки этот метод проложил путь для исследователей в области исследования рака для изучения генетических и эпигенетических изменений, приводящих к метастазированию опухолевых клеток в раке легких.