Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области эффероцитоза, такие как роль сигнальных молекул в опосредовании поглощения апоптотических клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает четкую количественную оценку поглощения апоптотических клеток, включая частичное или частичное поглощение апоптотических клеток, что не всегда очевидно при использовании других методов. Хотя этот метод может дать представление о эффероцитозе иммунных клеток, он также может быть применен к другим типам клеток, таким как эпителиальные или раковые клетки.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за сложности оптимизации настроек микроскопа. После подготовки макрофагов человека и апоптотических клеток Юрката используйте гемоцитометр для подсчета апоптотических клеток. Затем перенесите достаточное количество апоптотических клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Гранулируйте клетки Jurkat с помощью центрифугирования в 500 раз больше g в течение пяти минут. Затем повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах PBS. Пока ячейки Jurkat находятся в центрифуге, залейте 10 микролитров ДМСО в новую микроцентрифужную пробирку.

Затем растворите минимальное количество NHS-биотина в ДМСО. После этого перенесите 500 микролитров апоптотической клетки и суспензию PBS в пробирку, содержащую ДМСО и NHS-биотин. Затем разведите соответствующий краситель для отслеживания клеток в соответствии с инструкциями производителя.

Инкубируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте. Затем добавьте равный объем RPMI 1640 с 10% FBS и выдержите суспензию при комнатной температуре в темноте еще пять минут. После этого гранулируйте клетки с помощью центрифугирования в 500 раз больше g в течение пяти минут.

Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте окрашенные клетки в 100 микролитрах RPMI 1640 с 10% FBS. Добавьте по 100 микролитров окрашенной клеточной суспензии по капле в каждую лунку макрофагов. Затем центрифугируйте планшет при 200 умноженных на g в течение одной минуты.

Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2 в инкубаторе для тканевых культур. По истечении соответствующего инкубационного периода извлеките клетки из инкубатора. Затем дважды промойте клетки одним миллилитром PBS.

После этого в каждую лунку добавляют разведенный ФИТК-конъюгированный стрептавидин. И высиживаем тарелку 20 минут в темноте. Промойте клетки три раза одним миллилитром PBS, и аккуратно встряхивайте образцы в течение пяти минут после каждого полоскания.

Затем зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом в PBS на 20 минут при комнатной температуре. Промойте клетки один раз PBS, чтобы удалить избыток PFA. Закрепите покровные стекла на предметном стекле и перенесите предметное стекло на флуоресцентный микроскоп.

Захват Z-стеков из достаточного количества ячеек для количественного определения. Очень важно установить расстояние между указанными участками таким образом, чтобы был обнаружен весь поглощенный апоптотический материал. Максимальное расстояние между указанными секциями не должно превышать фокусную глубину объектива, обычно от 0,5 до одного микрометра.

Загрузите один из стеков Z в программное обеспечение с помощью функции импорта. Затем выберите «Интегрированная плотность» в качестве параметра измерения на панели «Задать измерения». Анализ проще всего выполнить, если и стрептавидин, и каналы красителя для отслеживания клеток отображаются в виде наложения.

Любой объект со стрептавидином в любом месте окружности должен считаться стрептавидин-положительным и, следовательно, не должен количественно определяться как стрептавидин-отрицательный. После загрузки изображения с помощью стрептавидина и инструмента Freehand или выделения полигона обведите весь негативный материал стрептавидина в одной плоскости стека Z. Затем измерьте интегральную интенсивность красителя для отслеживания клеток в этой области.

В том же разделе Z используйте окрашивание стрептавидином и инструмент выделения от руки или многоугольника, чтобы обвести весь материал с положительным результатом красителя для отслеживания клеток. Наконец, измерьте интегральную интенсивность этой области. С помощью этой процедуры более 95% клеток Юрката, обработанных Ставроспорином, прошли через апоптоз.

В большинстве экспериментов доля эффероцитированных клеток апоптоза увеличивалась в зависимости от времени. При оптимизации этого протокола для различных типов эффероцитарных клеток или различных мишеней апоптотических клеток важно проверить диапазон соотношения апоптотических клеток к эффероцитарным клеткам. Обычно лучше всего работают соотношения 10 к одному или 30 к одному.

Эта процедура может быть легко модифицирована для отслеживания активации сигнальных молекул или внутриклеточного трафика путем экспрессии флуоресцентных репортерных генов в эффероцитарных клетках, что позволяет визуализировать эти процессы во время эффероцитоза.