Количественная оценка завод растворимого белка и усваиваемых углеводов контента, используя кукурузы (Zea mays) как образец

Этот метод позволяет исследователям в области растениеводства и экологии питания точно измерять концентрации растворимых белков и легкоусвояемых углеводов в растительных тканях. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они предлагают быстрый и простой метод количественного определения этих двух невероятно важных макроэлементов с высокой точностью. Эти методы имеют большое значение для экологии, потому что растительные белки и углеводы составляют основу наземных пищевых сетей.

Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, могут испытывать трудности, потому что есть несколько этапов и некоторые методы, которые обычно не выполняются в лаборатории общего пользования. Для начала взвесьте повторяющиеся образцы каждой ткани в помеченные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Далее запишите точную массу каждого образца.

С помощью микропипетки добавьте в каждую пробирку 500 микролитров 0,1 молярного гидроксида натрия. Плотно закройте крышки и звуковым нагревом трубки в течение 30 минут. Далее поместите трубки в предварительно разогретую водяную баню на 15 минут.

После этого центрифугируйте пробирки при 15 000 G в течение 10 минут. Дозируйте надосадочную жидкость в новые пробирки с маркировкой для микроцентрифуг, используя новый наконечник для дозатора для каждого образца. Добавьте в гранулу 300 микролитров 0,1 моляра гидроксида натрия, и повторите центрифугирование в течение 10 минут.

После этого извлеките надосадочную жидкость и перенесите ее в пробирки, содержащие надосадочную жидкость из первого центрифугирования. Чтобы нейтрализовать pH надосадочной жидкости, добавьте 11 микролитров 5,8 молярной соляной кислоты. Используйте лакмусовую бумагу, чтобы подтвердить, что pH составляет примерно семь.

Далее добавьте в каждую трубочку по 90 микролитров 100% трихлоруксусной кислоты. Затем инкубируйте трубки на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте образцы при 13 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Осторожно используйте вакуумную линию и стеклянный наконечник микропипетки для удаления трихлоруксусной кислоты. Будьте очень осторожны, чтобы не потревожить гранулу с помощью всасывающего наконечника. Далее промойте гранулу со 100 микролитрами ацетона, охлажденного до 20 градусов Цельсия, после чего дайте ацетону испариться в вытяжном шкафу.

Растворите белковую гранулу с одним миллилитром гидроксида натрия. Могут потребоваться дополнительные раунды нагрева, вихревого и звукового нагрева. Добавьте по 160 микролитров каждого стандартного раствора IGG в 96-луночный планшет в трех экземплярах, начиная с позиции А1 Затем в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра добавьте по 50 микролитров каждого раствора образца на 950 микролитров дистиллированной воды.

Затем добавьте по 60 микролитров каждого разведенного образца в луночный планшет в трех экземплярах, начиная с положения Н1. Добавьте 100 микролитров дистиллированной воды во все пустые и неизвестные лунки для проб. С помощью многоканальной пипетки добавьте по 40 микролитров белкового красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 в каждую лунку пластины.

С помощью иглы лопайте все пузырьки, присутствующие в лунках. После этого дайте тарелке поинкубироваться при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем с помощью микропланшетного спектрофотометра запишите значения поглощения для каждой лунки на уровне 595 нанометров.

Во-первых, взвесьте реплики из каждого образца ткани в стеклянные пробирки объемом 15 миллилитров. Пробирки промаркируют и запишите точную массу каждого образца. Далее добавьте в каждую трубку по одному миллилитру 0,1 молярной серной кислоты и плотно закройте крышки.

Затем поместите трубки на баню с кипящей водой на один час. Переведите трубки на теплую водяную баню для остывания. Затем разлить содержимое пробирок в промаркированные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров

После этого центрифугируйте пробирки при 15 000 G в течение 10 минут. С помощью микропипетки перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки с маркировкой объемом 1,5 миллилитра. С помощью пипетки перенесите по 15 микролитров каждого неизвестного образца в собственную пробирку.

Затем добавьте в каждую трубку по 385 микролитров дистиллированной воды. В вытяжной шкаф добавьте 400 микролитров 5%-ного фенола в каждый стандартный и неизвестный образец пробирки. Сразу после этого добавьте по два миллилитра серной кислоты в каждую трубку.

Обязательно добавьте серную кислоту на поверхность раствора. После инкубации трубок в течение 10 минут сделайте трубки вихревыми. Затем инкубируйте трубку еще 30 минут.

Переложите 800 микролитров из каждой пробирки с образцом в три полистирольные полумикрокюветы объемом 1,5 миллилитров. Затем установите спектрофотометр на 490 нанометров и откалибруйте его с помощью пустой кюветы. Наконец, пропустите каждую кювету через спектрофотометр и запишите поглощение.

С помощью этого протокола было проанализировано содержание растворимого белка и легкоусвояемых углеводов в четырех различных тканях полевой и сладкой кукурузы из трех географических регионов. Значительные различия в содержании растворимого белка наблюдались между регионами, что потребовало проведения отдельных анализов для каждого региона. В разных регионах было выявлено несколько различий в содержании растворимого белка и легкоусвояемых углеводов между тканями.

В Миннесоте ткани различались только по содержанию растворимого белка, в то время как в Северной Каролине ткани различались как по растворимому белку, так и по легкоусвояемым углеводам. Вариабельность содержания макронутриентов в тканях в Техасе зависела от сорта. Этот метод позволит исследователям в области растениеводства и экологии питания точно измерять растворимый растительный белок и легкоусвояемые углеводы, а не экстраполировать элементарные показатели.

Не забывайте, что работа с жидким азотом, концентрированными кислотами и основаниями, может быть крайне опасной. Поэтому всегда используйте меры предосторожности, такие как перчатки, защитные очки, фартуки и обувь с закрытыми носками при работе с этими химическими веществами.