Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биофизической области, например, насколько силен один белок во взаимодействиях с белками. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно иммобилизовать широкий спектр различных биомолекул. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что работа с кантилевером атомно-силового микроскопа и работа с самим атомно-силовым микроскопом могут быть сложными.

Для начала наденьте кислотостойкие перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Под вытяжным шкафом используйте изопропанол в безворсовых прецизионных салфетках. Удалите крупную пыль и загрязнения с нескольких стекол.

Переложите чистые горки в стоячую банку, наполненную соляной кислотой, разведенной дважды дистиллированной водой. Закупорьте банку соответствующей крышкой и поставьте в ультразвуковую ванну на 90 минут при комнатной температуре. Затем перенесите консольные щупы AFM из нитрида кремния на чистое стеклянное стекло кончиком вверх.

Перенесите предметное стекло в камеру, непроницаемую для ультрафиолетового излучения и облучайте предметное стекло ультрафиолетовым светом сверху в течение не менее 90 минут. После этого замените соляную кислоту в банке для окрашивания дважды дистиллированной водой, следя за тем, чтобы поверхность стекла не высыхала. Закупорьте банку крышкой и поставьте ее обратно в ультразвуковую ванну еще на 10 минут.

Тем временем растворите этоксисилановую полиэтиленгликолевую кислоту в смеси этанола и дважды дистиллированной воды до конечной концентрации 0,1 миллиграмм на миллилитр. Герметично закупорьте этот раствор для того, чтобы предотвратить испарение этанола. Когда все будет готово, разлейте раствор силана в две отдельные чашки Петри.

Поместите чистые стеклянные стекла в одну чашку Петри, а консоль в другую. С помощью парапленки герметично закройте обе пластины, чтобы предотвратить испарение этанола. Инкубируйте стационарные планшеты в течение 90 минут при комнатной температуре.

После этого используйте три последовательных стакана, содержащих чистый этанол, для мытья как консольного, так и стеклянного стекол. Поместите вымытый кантилевер на чистое предметное стекло. Переложите функционализированные стеклянные стекла в банку для окрашивания.

Высушите оба в духовке при температуре 110 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем храните образцы силанизированного стекла и кантилевер в вакуумном эксикаторе в течение одной недели. Когда вы будете готовы начать произвольную иммобилизацию белков, приготовьте раствор, содержащий EDC и NHS в стандартном фосфатно-солевом буфере, как указано в текстовом протоколе.

Накройте этим раствором стеклянные предметные стекла с силановым покрытием. Поместите силанизированные консольные зонды в каплю раствора ECD/NHS. Выдерживайте оба в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем промойте кантилевер и предметные стекла в трех последовательных стаканах, чтобы полностью смыть излишки EDC/NHS. Перенесите активированные стеклянные стекла на чашку Петри, оборудованную влажной салфеткой. Добавьте каплю желаемого белкового раствора в активируемую EDC/NHS область предметного стекла, запечатайте чашку Петри с помощью парапленки и инкубируйте зонды при комнатной температуре.

Добавьте каплю нужного белкового раствора в консольный ящик, оснащенный влажной салфеткой. Затем тщательно промойте консольные щупы с помощью PBS. Поместите щупы в каплю в коробке и закройте коробку.

Инкубируйте зонды при комнатной температуре. После этого отметьте область попадания белковой капли на тыльной стороне стекла предметного стекла. Тщательно вымойте стекла и консольные щупы с помощью трех последовательных стаканов, наполненных PBS.

Поместите промытые зонды в сосуд с трис-буферным физиологическим раствором на 20 минут при комнатной температуре. Затем тщательно вымойте предметные стекла и консольные щупы с помощью PBS. Храните их в отдельных чашках Петри, покрытых PBS, до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

Закрепите только что очищенное предметное стекло на держателе образца AFM и накройте его буфером PBS. Далее закрепите подготовленный консольный щуп на держателе кантилевера и поместите его в головку АСМ. Тщательно смочите кантилевер каплей буфера PBS.

Медленно перемещайте кантилевер к калибровочной поверхности до тех пор, пока кантилевер не будет полностью погружен в буфер PBS, но все еще находится вдали от калибровочной поверхности. Используйте оптический микроскоп с видом сверху или инвертированный микроскоп АСМ, чтобы расположить лазер на задней стороне консоли. Поместите лазерное пятно рядом с концом кантилевера рядом с тем местом, где расположен наконечник, и отрегулируйте положение на четырехквадрантном фотодиоде детектора АСМ таким образом, чтобы отраженный лазерный луч располагался в центре фотодиода.

Далее откройте диспетчер калибровки в программном обеспечении АСМ. Чтобы начать калибровку чувствительности кантилевера и постоянной пружины, осторожно подойдите к поверхности подложки и запишите кривую расстояния силы. Подогните прямую линию к самой крутой части кривой силы втягивания, где наконечник соприкасается с поверхностью подложки, чтобы определить чувствительность оптического рычага.

Отведите кантилевер от поверхности образца и зарегистрируйте несколько спектров теплового шума с помощью кантилевера на расстоянии не менее 100 мкм от поверхности и подогните гармонический генератор, предоставленный программным обеспечением АСМ, к спектрам теплового шума для определения постоянной пружины консоли. После этого медленно втяните кантилевер и извлеките его из раствора. Снимите стеклянную поверхность, используемую для калибровки кантилевера, и замените ее поверхностью образца, содержащей иммобилизованные белки.

Медленно перемещайте влажный кантилевер к поверхности образца до тех пор, пока кантилевер не будет полностью покрыт буфером PBS, но все еще удален от поверхности подложки. Подойдите к поверхности и запишите множественные кривые расстояния сил в разных местах на поверхности образца с силой контакта 250 пиконьютонов, временем контакта одной секундой, длиной втягивания двух микрометров и скоростью втягивания одним микрометром в секунду. В программном обеспечении для обработки данных выберите Открыть пакет Force Scan'icon, чтобы открыть файлы измеренной кривой силы.

Выберите значок Повторная калибровка отклонения V путем регулировки чувствительности в геометрической постоянной пружины, чтобы преобразовать отклонение кантилевера в прямо пропорциональную силу. Затем выберите значок Вычитание базовой линии, чтобы вычесть базовую линию канала втягивания в области кривой силы, удаленной от поверхности, которая также устанавливает нулевой уровень силы. Выберите значок «Определение точки контакта», чтобы определить точку, в которой наконечник соприкасается с образцом.

Выберите значок Tip Sample Separation, чтобы преобразовать сигнал высоты в разделение сэмплов зонда. Помимо вычитания положения точки контакта, при этом вычитается изгиб кантилевера для расчета расстояния между поверхностью подложки и наконечником АСМ. Выберите значок Fit a Polymer Chain Model, а затем выберите модель Extensible Worm-like Chain, чтобы отобразить трассировки расстояния силы для пиков силы, возникающих при длине разрыва более 70 нанометров.

Отсортируйте неспецифические взаимодействия и примените к выбранным пикам модель расширяемой червеобразной цепи. В этом исследовании белки ковалентно иммобилизуются со случайной ориентацией через их доступные первичные амины. На АСМ-изображении слоя силанизированного полимера видны лишь небольшие поверхностные гофры высотой от двух до пяти нанометров.

Тем не менее, видно, что поверхность, функционализированная фибронектином, имеет молекулы фибронектина высотой около 10 нанометров. При ближайшем рассмотрении выясняется, что димерная структура молекул может быть распознана. Эти молекулы кажутся компактными, с высотой от четырех до пяти нанометров над поверхностным покрытием ПЭГ и длиной около 120 нанометров.

Затем исследуются силы взаимодействия RRGA с фибронектином. Репрезентативные кривые разделения образцов зонда, записанные с пользованной скоростью один микрон в секунду, показали низкое фоновое взаимодействие и хорошо сформированные события взаимодействия, которые затем подгоняются с использованием расширяемой модели червеобразной цепи. Построение графиков результатов этой аппроксимации показывает, что после преодоления неспецифических поверхностных взаимодействий при растяжении линкеров ПЭГ до 19% кривых силы имеют события разрыва со средней силой разрыва 52 пиконьютона для взаимодействия фибронектина RRGA и на расстоянии образца зонда около 100 нанометров.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что в зависимости от таких настроек, как время контакта или скорость втягивания, данные силовой спектроскопии одной молекулы содержат множество информации, и что этот протокол может быть только первым шагом к полному анализу данных. В то время как этот метод может дать представление о взаимодействиях отдельных молекул, он также может быть использован для изучения взаимодействий на уровне отдельных клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как силовая спектроскопия отдельных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как целые клетки взаимодействуют с покрытыми белком поверхностями.

Не забывайте, что работа с кислотами и ультрафиолетовым излучением может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как кислотостойкие перчатки и непроницаемая для ультрафиолетового излучения камера.