Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

Мы опишем три экспериментальные методы для оценки деятельности гипопигментация химических веществ в пробирке: количественная оценка деятельности и 2) меланина содержание 1) сотовых тирозиназы и 3) измерение меланина сотовой меланина окрашивание и изображения анализа.

Этот метод может быть полезен в развитии функциональной косметики и кожных средств с антимеланогенной деятельностью. Это там, чтобы выполнить и результат может быть получен быстро. Кроме того, этот метод может быть полезен для исследователей, которые хотят определить или исследовать эффекты или соединения или исследовать антимеланогенную или промеланогенную деятельность.

Измерение активности тирозиназы начинается с посева меланицидов B16-F10 в пять раз от 10 до четвертых клеток на колодец 24 хорошо концентрации пластины в полной среде в течение 24 часов в инкубаторе клеточной культуры. На следующий день замените супернатант в каждом хорошо с DMEM дополнен свежеприготовленным тестовым соединением и ингибитор контроля или отрицательного контроля и вернуть пластину в инкубатор еще на 72 часа. В конце обработки промыть скважины два раза с 300 микролитров холодного pbs на колодец и поместить пластину на лед.

Затем добавьте 300 микролитров буфера лиза к каждому хорошо с помощью сотового скребка для сбора лизайтов ячейки через пять минут. Перенесите полученные суспензии частиц клеток в отдельные микро-центрифуги на 1,5 миллилитровые трубки. И гомогенизировать лизаты три раза в течение двух секунд при 14500 об/мин на льду, чтобы освободить межклеточный тирозиназы.

Пеллет клеточного мусора путем центрифугации и передачи супернатантов в отдельных 1,5 миллилитров центрифуги труб на льду. Выделите 70 микролитров каждого супернатанта на отдельные скважины ясной 96 скважины полистирола микро пластины и добавить 140 микролитров тирозиназы субстрат решение каждой скважины супернатанта. Встряхивание пластины нежный, чтобы смешать содержимое хорошо.

Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. И измерить активность тирозиназы на 475 нанометров на микроплатформенной считыватель. Измерить содержание меланина в клетках после сбора лизата обработанных клеток, как это было продемонстрировано.

Соберите лизаты путем центрифугации и перенесите супернатанты в новые трубки. Добавьте 300 микролитров одного нормального гидроксида натрия к каждой грануле в течение одного часа инкубации при 60 градусах по Цельсию. За этим следует центрифугация растворенных клеточных суспензий.

Затем перенесите 200 микролитров супернатантов на каждый колодец из 96 хорошо пластины. И измерить содержание меланина на микропластине читателя на 400 нанометров длине волны. Для Фонтана-Массон Стейнс, мыть обработанные клетки два раза с 300 микролитров холодного pbs и исправить клетки с 200 микролитров 10%формалин в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию.

Промыть толстые клетки дистиллированной водой и добавить 200 микролитров от 58 до 68 градусов по Цельсию аммиачных серебра рабочий раствор для каждой хорошо. В течение одного часа инкубации при 37 градусах по Цельсию или до тех пор, пока клетки не станут желто-коричневого цвета. Промыть окрашенные клетки дистиллированной водой с последующим двухминутным инкубацией в 0,1%золото хлорида при комнатной температуре.

Промыть клетки хлорида золота дистиллированной водой и добавить 200 микролитров раствора тиосульфата натрия в клетки. Через две минуты снова промыть клетки. И этикетки клеток с 200 микролитров ядерного быстрого красного на колодец в течение пяти минут.

Затем мыть окрашенные клетки с водопроводной водой перед изображением под световым микроскопом. Для анализа порога откройте изображения на изображении J и выберите изображение, отрегулируйте и цветовый порог. Для измерения площади, окрашенной Fontana Masson, установите планку параметра яркости до нуля и отрегулируйте яркость до точки, в которую включены все черные или коричневые окрашенные ячейки.

Выберите анализ и анализ частиц и проверьте поле суммы в окне Analyze Particles, затем нажмите кнопку «Хорошо», чтобы получить резюме результатов и скопировать и вставить данные в электронную таблицу. Лечение Арбутина значительно подавляет активность клеточной тирозиназы по сравнению с клетками, обработанными транспортным средством. Аналогичным образом содержание меланина в клетках, стимулируемых Арбутином, значительно снижается по сравнению с контролем.

Хотя клетки морфологически похожи между группами лечения, Арбутин уменьшает площадь черного пигмента по сравнению с контрольными обработанными клетками. Этот метод полезен для скрининга деятельности с помощью нашей библиотеки соединения. Есть более сотни образцов, которые должны быть проверены быстро.

Кроме того, этот метод также может быть использован для исследования механизма, связанного с меланогенезом. После того, как биологически активные кандидаты соединения были определены, для их показания к изучению биологических механизмов или коммерческого применения.